一種羰基還原酶及其在合成手性羥基化合物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種羰基還原酶，含有編碼該酶的核苷酸序 列的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，表達(dá)的重組酶和該重組酶的制備方法，以及該羰基 還原酶作為催化劑在不對(duì)稱合成手性羥基化合物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 含有特定功能基團(tuán)的光學(xué)活性手性醇是合成藥物、農(nóng)藥及其它精細(xì)化學(xué)品的重 要手性砌塊。而其中的手性芳香醇是合成手性藥物、生物堿和其它手性化合物的重要中 間體，是一大類有著重要工業(yè)潛力的有機(jī)化合物，在當(dāng)今制藥領(lǐng)域里有著重要的作用。比 如，（S)-(+)-l，l-二苯基-2-丙醇及（R)-(-)-l，l-二苯基-2-丙醇可以通過氨化反 應(yīng)制成有用的手性芳香胺化合物，進(jìn)而合成手性農(nóng)用化學(xué)品和手性醫(yī)用藥物；再比如， (S)-4-(l-羥基乙基）喹啉-2-羧酸是硫鏈絲霉肽（Thiostrepton)的重要中間體；再比如， (S) _1_(2, 6-二氯_3_氣代苯基）乙醇是合成克唑替尼的重要中間體；又如（S) _2_ (2-氯 代苯基）-2-羥基乙酸甲酯是合成用于治療腦卒中、心肌梗死的暢銷藥氯吡格雷的重要中 間體。這樣的用作藥物中間體的手性芳香醇在制藥領(lǐng)域中很多。
[0003] 對(duì)于手性芳香醇的合成主要有兩種途徑：一是通過對(duì)潛手性芳香酮的對(duì)映選擇性 還原，二是可以通過對(duì)外消旋體的拆分實(shí)現(xiàn)。
[0004] 針對(duì)第一種途徑，目前發(fā)展得比較成熟的有三種方法：第一是使用手性配體修飾 的金屬氫化物試劑，在這些化合物中，將活潑氫的數(shù)目減至最小以獲得高度的化學(xué)選擇性， 引入的手性配體則為對(duì)映面選擇性做出貢獻(xiàn)，應(yīng)用比較廣泛的試劑是一種聯(lián)萘酚修飾的氫 化鋁試劑，簡(jiǎn)稱BINAL-H ;第二種方法是在氫化反應(yīng)中使用過渡金屬絡(luò)合物進(jìn)行催化，常用 的過渡金屬有釕和銠；第三種方法是使用硼雜噁唑烷催化體系，在使用硼烷還原羰基化合 物的過程中，引入手性的硼雜惡唑烷，使前兩者在反應(yīng)面的某一側(cè)足夠靠近發(fā)生反應(yīng)，該體 系被命名為CBS體系。目前，對(duì)于潛手性芳香酮的不對(duì)稱還原已經(jīng)發(fā)展得比較成熟，但是上 述幾種方法都需采用一些比較昂貴不易獲得的試劑或配體，不適合大規(guī)模的制備手性醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)已報(bào)道的制備手性芳香醇的反應(yīng)中收率低、 反應(yīng)條件苛刻等問題，提供了一種催化活性高、對(duì)映選擇性強(qiáng)、底物耐受性好的羰基還原 酶，以及使用該羰基還原酶催化合成手性芳香醇的方法。還提供了編碼該羰基還原酶的核 苷酸序列，含有該核苷酸序列的重組表達(dá)載體、重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體及該羰基還原酶的制備方 法，以及該羰基還原酶在催化羰基底物不對(duì)稱還原中的用途。
[0006] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案以解決上述技術(shù)問題：
[0007] 本發(fā)明的第一方面提供了一種羰基還原酶，其是如下（a)或（b)的蛋白質(zhì)：
[0008] (a)由SEQ ID No: 1所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0009] SEQ ID No: 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)由來源于鏈霉菌Sreptacidiphilus albus的基因編碼，具有羰基還原酶的功能，是一種新的羰基還原酶。
[0010] (b)在（a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基衍生的 具有羰基還原酶活性的蛋白質(zhì)。
[0011] 其中，所述的"幾個(gè)"是指2個(gè)至100個(gè)，更佳地小于30個(gè)，最佳地小于10個(gè)。比 如添加一個(gè)外分泌信號(hào)肽的融合蛋白，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這樣的融合蛋白同樣具有羰基還原酶 活性。也就是說，只要由（a)衍生的蛋白質(zhì)具有羰基還原酶活性，且衍生方式如上所述，都 可以達(dá)到本發(fā)明的發(fā)明目的。根據(jù)本發(fā)明，在如SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)（a) 分子中進(jìn)行1~5個(gè)氨基酸殘基的突變，仍然保持羰基還原酶活性。
[0012] SEQ ID No: 1所示的羰基還原酶和其他已知羰基還原酶之間的同一性為50%。本 發(fā)明的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示的羰基還原酶與已知羰基還原酶的氨基酸序列的同 一*性低于90%，具有顯著差異性。
[0013] 在本文中，氨基酸序列之間的同一性是根據(jù)序列的全長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算，優(yōu)選采用NCBI Blastp程序進(jìn)行比對(duì)，默認(rèn)參數(shù)。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明的羰基還原酶。優(yōu)選 地，所述核酸是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列組成的。
[0015] 由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列組成的核酸來源于鏈霉菌Sreptacidiphilus albus基因組，其可以從基因組DNA中分離獲得，也可以從含有該核酸的重組表達(dá)載體中或 重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以全基因人工合成獲得。
[0016] 本發(fā)明中，SEQIDNo:2所示的基因命名為ABY-KRED-SA，全長(zhǎng)828bp。其中，其編 碼序列（⑶S)從第1個(gè)堿基起至第825個(gè)堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。該 序列無內(nèi)含子，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N〇:l所示。
[0017] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ ID No: 1的氨基酸序列的 核苷酸序列不僅僅局限于SEQ ID N〇:2。本發(fā)明的羰基還原酶基因的核苷酸序列也可以是 編碼序列表中SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，還可以通過適 當(dāng)引入替換、缺失或插入來提供一個(gè)多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明中多聚核苷酸的同系物 可以通過對(duì)核苷酸序列SEQ ID N〇:2的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺 失或添加來制得。
[0018] SEQ ID N〇:2的同系物也指啟動(dòng)子變體。在所述的核苷酸序列之前的啟動(dòng)子或信 號(hào)序列可通過一個(gè)或多個(gè)核酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對(duì)啟動(dòng)子的功能沒 有負(fù)面影響。而且通過改變啟動(dòng)子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動(dòng)子完 全替換，可提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。
[0019] SEQ ID No:2的同系物還指在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠與SEQ ID No:2所示序列的核酸 進(jìn)行雜交的核苷酸序列。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行雜交可根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中描述的 方式進(jìn)行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物學(xué)中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具體來說，雜交可以按照如下步驟進(jìn)行：將一個(gè)載 有被轉(zhuǎn)錄的待測(cè)DNA或RNA分子的膜與一個(gè)標(biāo)記探針在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交；雜交緩沖 液的組成為〇· lwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑以及2~8XSSC ; 20 X SSC為3M氯化鈉和0. 3M的檸檬酸組成的溶液；雜交溫度為50~70°C ;在培養(yǎng)幾個(gè)小 時(shí)或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜；清洗溫度為室溫，更優(yōu)選為雜交溫度；清洗緩沖液的組 成為6X SSC+O. Iwt % SDS溶液，更優(yōu)選為5X SSC+O. Iwt % SDS ;當(dāng)用這種清洗緩沖液清洗 完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內(nèi)被雜交的探針上的標(biāo)記來識(shí)別DNA或RNA分子。
[0020] 本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種包含本發(fā)明的編碼羰基還原酶的核苷酸序列的 重組表達(dá)載體。其可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明所述的編碼羰基還原酶或其突變體的核 苷酸序列連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體， 如市售的質(zhì)粒、粘粒、菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒pET28a。較佳地，可通過下述方法制得 本發(fā)明的重組表達(dá)載體：將通過PCR擴(kuò)增所得的目的核酸片段與表達(dá)載體pET28a分別用限 制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII雙酶切，形成互補(bǔ)的粘性末端，經(jīng)T4DNA連接酶連接，形成含有 本發(fā)明的編碼羰基還原酶的核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒pABI-ADH-SA或含有編碼其突變 體的核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0021] 本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了一種包含本發(fā)明的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。 可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中制得。所述的宿主細(xì)胞可為本領(lǐng)域常規(guī) 的宿主細(xì)胞，只要能滿足重組表達(dá)載體可穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的還原酶基 因可被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌（E.Coli)，更優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。將前 述重組表達(dá)質(zhì)粒pABI-ADH-SA或其突變體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，即可獲得本發(fā)明 優(yōu)選的基因工程菌株，即sABI-ADH-SA或其突變體。轉(zhuǎn)化方法可選擇本領(lǐng)域常規(guī)方法，如電 轉(zhuǎn)法，熱擊法等；較佳地選擇熱擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，熱擊條件較佳的是：42°C，熱擊90秒。
[0022] 本發(fā)明的第五方面提供一種重組羰基還原酶的制備方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的 重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及從培養(yǎng)物中獲得重組羰基還原酶。
[0023] 其中，所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體同前述介紹，可通過將本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 至宿主細(xì)胞得到。所述的培養(yǎng)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域常規(guī)的任何可使 轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)并表達(dá)本發(fā)明的羰基還原酶的培養(yǎng)基，對(duì)于大腸桿菌菌株，優(yōu)選LB培養(yǎng)基（蛋 白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. 0)。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可 以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不同按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要能使轉(zhuǎn) 化體生長(zhǎng)并表達(dá)本發(fā)明的羰基還原酶即可。其他培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī) 操作進(jìn)行。對(duì)于大腸桿菌菌株，搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵較佳地選用下述方法：將本發(fā)明的重組大腸桿 菌（優(yōu)選BL21(DE3)或其突變體）接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密 度〇D_達(dá)到0. 6~0. 8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度20~40°C (更佳地是30°C )，即可高效表達(dá)本發(fā)明所述重組羰 基還原酶。
[0024] 本發(fā)明中催化前手性羰基化合物進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)形成光學(xué)活性手性醇的催 化劑，可以是上述重組轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，也可以是通過將該培養(yǎng)物離心分離后得到的轉(zhuǎn)化 體細(xì)胞或者用其加工的制品。這里"加工的制品"是指由轉(zhuǎn)化體得到的提取物、或通過對(duì)提 取物中的羰基還原酶進(jìn)行分離和/或純化得到的分離產(chǎn)品，或者通過固定化轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或 提取物或轉(zhuǎn)化體的分離產(chǎn)品而得到的固定化制品。
[0025] 本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了一種本發(fā)明的羰基還原酶或重組羰基還原酶在催化 前手性羰基化合物進(jìn)行不對(duì)稱還原反應(yīng)形成手性羥基化合物中的應(yīng)用。
[0026] 所述的前手性羰基化合物為芳基酮類化合物。
[0028] 其中，
[0029] X表示被鹵素、烷基、烷氧基、羥基或取代烷基中的任一取代基取代；
[0030] R選自H、Cl~C8支鏈或直鏈烷基或含有2~8個(gè)碳原子的酯基；
[0031] Y為H、Cl~C4烷基或含有2~8個(gè)碳原