一種秸稈還田纖維分解性生防真菌及菌劑和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種秸桿還田纖維分解性生防真菌及菌劑和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)作物秸桿養(yǎng)分資源十分豐富，利用秸桿還田技術(shù)將農(nóng)作物秸桿轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)的 有機(jī)肥，可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)的良性循環(huán)，能夠有效的解決因重復(fù)耕種導(dǎo)致的土 壤養(yǎng)分耗竭、肥力下降等問題，也能有效控制農(nóng)村大氣環(huán)境污染，是實(shí)現(xiàn)我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā) 展和農(nóng)村生態(tài)環(huán)境建設(shè)的重要措施。但是傳統(tǒng)的秸桿原位還田技術(shù)中秸桿的降解速度緩 慢，秸桿中的養(yǎng)分不能為當(dāng)季作物充分利用，影響土壤耕作、種子萌發(fā)和作物苗期生長(zhǎng)，此 外還致使一些蟲害和病原菌在土壤中長(zhǎng)時(shí)間存活，給作物帶來(lái)潛在危害，從而限制了其推 廣應(yīng)用。
[0003] 環(huán)境中的微生物可以通過(guò)生物催化作用對(duì)秸桿中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等 組分進(jìn)行有效降解，從而達(dá)到農(nóng)作物秸桿高效還田的目的。真菌一般具有相對(duì)完整的酶系， 對(duì)農(nóng)作物秸桿的降解能力更為強(qiáng)大，尤其是生防真菌在加速秸桿降解的過(guò)程中，還可以對(duì) 植物的病害進(jìn)行生物防治。如果在秸桿機(jī)械還田的基礎(chǔ)上，配合接種篩選的高效分解生防 真菌，必將能夠加速和優(yōu)化農(nóng)作物秸桿的腐熟過(guò)程，對(duì)提高秸桿利用效率、防治病蟲害、強(qiáng) 化土壤有機(jī)質(zhì)積累，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力水平具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種秸桿還田纖維分 解性生防真菌及其應(yīng)用，該菌不僅具有較強(qiáng)的纖維素酶、半纖維素和果膠較強(qiáng)的分解能力， 同時(shí)還具有潛在的抑制植物病原菌的能力，從而加速和優(yōu)化了農(nóng)作物秸桿的腐熟過(guò)程。其 是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種秸桿還田纖維分解性生防真菌，該菌株F7JX993849的分 類命名為綠木霉Trichodermavirens，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3. 17613。
[0005] 優(yōu)選的，所述綠木霉F7JX993849對(duì)辣椒疫霉菌、番茄灰霉菌、西瓜蔓枯病菌、蘋果 腐爛病菌有抑菌作用。
[0006] 其次，秸桿還田纖維分解性生防真菌在腐解水稻秸桿中的應(yīng)用。
[0007] 此外，本發(fā)明還提出一種含有上述秸桿還田纖維分解性生防真菌的腐熟菌劑，其 是通過(guò)下述制備方法而成，A、種子液的制備：將綠木霉F7 JX993849菌株的原始菌株無(wú)菌 條件下接種于PDA固體培養(yǎng)基上，30°C，培養(yǎng)2d;將活化后的菌種無(wú)菌條件下接種于種子培 養(yǎng)基中，30°C，180rpm條件下培養(yǎng)72h，制得種子液；B、發(fā)酵菌種的培養(yǎng)：將步驟A制得的種 子液按液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為20 %的接種量，將種子接種于發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵 培養(yǎng)，得到發(fā)酵菌種；C、腐熟菌劑的制成：將步驟B得到的發(fā)酵培養(yǎng)菌種接種于裝有麥麩的 固體發(fā)酵設(shè)備中，發(fā)酵培養(yǎng)7d后，經(jīng)過(guò)常溫干燥，粉碎后即可得本發(fā)明的F7 JX993849腐熟 囷劑成品。
[0008] 進(jìn)一步地，種子培養(yǎng)基組分為：葡萄糖20g，酵母膏I. 0g，（NH4)2SO4 0. 4g，KH2PO4 〇? 25g，蛋白胨 0?lg，MgSO4 ? 7H20 0?Olg，蒸餾水定容到 1000mL。
[0009] 進(jìn)一步地，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比為：糖蜜15%，（NH4)2SO4 0. 5%，蛋白胨0. 5%、CaCO3S3%、余量為水。
[0010] 進(jìn)一步地，所述高密度發(fā)酵期間通氣量為15L/min，攪拌速度為300r/min，發(fā)酵溫 度 30°C。
[0011] 再次，本發(fā)明還提出含有秸桿還田纖維分解性生防真菌的腐熟菌劑在水稻秸桿還 田中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步地，施用該腐熟菌劑提高了秸桿的腐解速度和有機(jī)質(zhì)釋放速度。
[0013] 進(jìn)一步地，將該腐熟菌劑應(yīng)用于水稻秸桿，水稻秸桿的腐解率和有機(jī)質(zhì)釋放率分 別為 54. 38 % 和 49. 76%。
[0014] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)為：本發(fā)明的綠木霉Trichoderma virens F7JX993849對(duì)農(nóng)作物秸桿中的纖維素、半纖維素和果膠組分同時(shí)具有較強(qiáng)的分解能力。其 次，本發(fā)明的綠木霉Trichoderma virens F7JX993849可以詰抗植物病原菌入侵，具有生物 防治功能。再次，本發(fā)明的秸桿還田纖維分解性生防真菌所制成的菌劑，可以解決一般秸桿 腐熟劑在應(yīng)用過(guò)程中效果不理想、不穩(wěn)定的問題，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作一簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā) 明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0016] 圖1為本發(fā)明綠木霉平板圖。
[0017] 圖2為本發(fā)明綠木霉18SrDNAITS序列電泳圖（marker從上到下依次為：1000， 700, 500,400, 300, 200 和 IOObp)。
[0018] 圖3為水稻秸桿的腐解率。
[0019] 圖4為水稻秸桿腐解過(guò)程中有機(jī)質(zhì)的釋放率。
[0020] 生物材料樣品保藏信息：
[0021] 綠木霉Trichoderma virens F7JX993849,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2015年 6月29日，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 3. 17613。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023] 實(shí)施例一，綠木霉F7JX993849的篩選
[0024] -、菌株的分離及純化
[0025] 采集水稻秸桿還田土壤樣品5g，置于含有IOOmL富集培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)溫度 30°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，恒溫培養(yǎng)。每隔4d，以10%接種量接入另一富集培養(yǎng)基中，如此 反復(fù)馴化5次。富集培養(yǎng)基采用水稻秸桿粉為唯一碳源。
[0026] 取150yL經(jīng)上述訓(xùn)化后的富集培養(yǎng)液在羧甲基纖維素鈉-剛果紅培養(yǎng)基上涂布， 30°C，培養(yǎng)4d。挑取水解圈直徑較大的菌體轉(zhuǎn)接到以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽 培養(yǎng)基中，連續(xù)繼代培養(yǎng)10代以上。邊傳代邊挑選出降解能力保持較好的樣品，以致馴化 出高效和穩(wěn)定的纖維素降解菌。菌落形態(tài)穩(wěn)定后，即得純培養(yǎng)，如圖1所示。
[0027] 二、綠木霉F7JX993849菌株的鑒定
[0028]A:形態(tài)特征：
[0029] 該菌株在PDA培養(yǎng)基上廣鋪，最初為白色致密的基質(zhì)菌絲，而后出現(xiàn)棉絮狀氣生 菌絲，并形成密實(shí)叢束區(qū)，最后整個(gè)菌落全部變成綠色。用電鏡觀察綠木霉F7JX993849菌 絲及孢子，菌絲透明、有隔、壁光滑、分枝繁復(fù)，厚坦孢子出現(xiàn)在菌絲中間，球形，壁光滑，分 生孢子梗大部分有側(cè)枝，側(cè)枝上對(duì)稱或互生分枝，形成二級(jí)和三級(jí)分枝，分生孢子多為卵圓 形，無(wú)色或綠色，簇生于小梗頂端，是典型的綠木霉分類特征。
[0030] B:分子遺傳學(xué)分類鑒定：
[0031] 提取到該菌株的DNA后進(jìn)行真菌18SrDNAITS序列PCR擴(kuò)增，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與綠木霉（Trichodermavirens，登錄號(hào)為AF099008.1)的 DNA序列同源性為99%。結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定結(jié)果，鑒定菌株為木霉，分類種名為綠木 霉（Trichodermavirens)〇
[0032] 將該菌株命名為F7JX993849,進(jìn)行菌種保藏，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，保藏日期：2015年6月29日，綠木霉TrichodermavirensF7的保藏編號(hào) 為CGMCCNo. 3. 17613。
[0033] 實(shí)施例二，綠木霉F7JX993849對(duì)秸桿腐解作用的確定
[0034] 2. 1綠木霉F7JX993849菌懸液的制備：
[0035] 將活化好的綠木霉F7JX993849菌株接種到滅菌的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)液 體培養(yǎng)基中，該液體培養(yǎng)基的組分為：CMC-Na2. 0g，酵母膏l(xiāng).Og，（NH4)2S04 0 . 4g，KH2PO4 〇? 25g，蛋白胨 0?lg，MgSO4 .7H20O.Olg，蒸餾水定容到 1000mL，pH7.0, 28°C，180rpm，振蕩 培養(yǎng)24h，制成菌懸液即F7JX993849菌懸液。
[0036] 2. 2粗酶液的制備：
[0037] 將2. 1中制得的F7JX993849菌懸液按照5%接種量接種到水稻秸桿培養(yǎng)基中。水 稻秸桿培養(yǎng)基的組分為：水稻秸桿干粉5g，酵母膏l(xiāng).Og，（NH4)2SO4 0.4g，KH2PO4 0.25g，蛋 白胨0.lg，MgSO4 ? 7H20 0. 01g，蒸餾水定容到1000mL，pH7. 0,（其中水稻秸桿干粉為水稻 秸桿晾干粉碎后，過(guò)20目篩）。設(shè)置無(wú)菌水代替F7菌懸液的對(duì)照。28°C，200rpm震蕩培養(yǎng) 96h，4°C下離心收集發(fā)酵液，上清液即為粗酶液。
[0038]2. 3酶活的測(cè)定：
[0039] 內(nèi)切型葡聚糖酶（CMCase)酶活測(cè)定：取25mL的刻度試管，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶 液0. 5mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的CMC-Na緩沖溶液lmL，50°C保溫30min。
[0040] 濾紙酶（FPase)酶活測(cè)定：取25mL的刻度試管，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液0. 5mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的朽1檬酸緩沖溶液（pH5. 4)lmL，并加入一條IcmX6cm的濾紙，50°C保溫 Ih0
[0041] 木聚糖酶酶活測(cè)定：取25mL的刻度試管，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液0. 5mL和質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為1%的木聚糖溶液lmL，50°C保溫30min。
[0042] 果膠酶酶活測(cè)定：取25mL的刻度試管，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液0. 5mL和質(zhì)量分 數(shù)為1%的果膠溶液lmL，50°C保溫30min。
[0043] 米用DNS法(Measurementofcellulaseactivities.GhoseTK，1987,Pure