一種利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種蛹蟲草液體發(fā)酵技術(shù)，特別涉及一種利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的方法。
【背景技術(shù)】
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)，屬子囊菌門(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreale)麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲，主要產(chǎn)于中國(guó)青海、西藏、四川、云南、甘肅和貴州等省及自治區(qū)的高寒地帶和雪山草原，自然資源十分稀少且子實(shí)體不能人工培養(yǎng)。
[0003]蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)屬子囊菌門(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreale)麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，主要分布在東北、華北、西北等省份，云南、貴州、四川、重慶等南方省區(qū)也有分布，生長(zhǎng)在較低海拔的平原地域。蛹蟲草是與冬蟲夏草同屬的食藥用真菌，世界上天然資源分布數(shù)量少。蛹蟲草與冬蟲夏草具有相似的藥用和滋補(bǔ)功能，蛹蟲草中的蟲草素、蟲草酸與蟲草多糖具有抗菌消炎、抗衰老、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，而且比冬蟲夏草更易于進(jìn)行人工栽培。因此蛹蟲草被選為冬蟲夏草的最佳替代品而進(jìn)行大量的人工培育。蛹蟲草菌種的制備是生產(chǎn)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。一般蛹蟲草菌種的生產(chǎn)采用三級(jí)制種方法。即母種、原種、生產(chǎn)種。要想生產(chǎn)出合格的菌種，必須先培育出母種，而后由母種制成原種，由原種制成生產(chǎn)種，而后用生產(chǎn)種轉(zhuǎn)接至小麥培養(yǎng)基，再進(jìn)行培養(yǎng)子實(shí)體管理。其中原種和生產(chǎn)種可利用液體發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行制種。
液體發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)之一，它是指在生化反應(yīng)器中，模仿自然界將菌株在生育過(guò)程中所必需的糖類、有機(jī)和無(wú)機(jī)含有氮素的化合物、無(wú)機(jī)鹽等一些微量元素以及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中作為培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，提供適于菌體代謝所需要的環(huán)境，并控制適宜的外界條件，進(jìn)行大量培養(yǎng)繁殖的過(guò)程。工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)即為發(fā)酵生產(chǎn)，亦稱深層培養(yǎng)或沉沒(méi)培養(yǎng)。發(fā)酵液直接供作藥用或供分離提取，也可以作液體菌種。傳統(tǒng)液體發(fā)酵方法主要為搖床培養(yǎng)、吹氣培養(yǎng)及發(fā)酵罐三種方法:搖床培養(yǎng)具有設(shè)備占用空間大、噪音大等缺點(diǎn)，而且搖床要配合500mL三角瓶使用，單瓶容量低，影響菌種產(chǎn)量；吹氣培養(yǎng)具有生產(chǎn)成本高、生物量低、工藝復(fù)雜、易染雜菌等缺點(diǎn)，而且一旦感染雜菌會(huì)使整批液體菌種感染，嚴(yán)重影響生產(chǎn)進(jìn)度；發(fā)酵罐培養(yǎng)為攪拌與吹氣培養(yǎng)相結(jié)合，但操作復(fù)雜、體量大應(yīng)用不靈活。
磁力攪拌是利用永磁體與攪拌子相互作用對(duì)目標(biāo)液體進(jìn)行攪拌的一種方法，通常用磁力攪拌器與攪拌子配合使用。將液體倒入容器，同時(shí)將攪拌子放入液體中，當(dāng)磁力攪拌器工作時(shí)，帶動(dòng)攪拌子成圓周循環(huán)運(yùn)動(dòng)從而達(dá)到攪拌液體的目的。近年來(lái)，蛹蟲草的保健功能越來(lái)越得到人們的認(rèn)可，產(chǎn)量一直不斷增加，但隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，液體菌種的產(chǎn)量受限于技術(shù)原因，生產(chǎn)量一直較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用磁力攪拌器培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的方法，采用本發(fā)明能夠提高蛹蟲草液體菌種的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種利用磁力攪拌生產(chǎn)蛹蟲草液體菌種的方法，如下:
(1)、培養(yǎng)液的配制:土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、檸檬酸三銨lg、維生素B1 0.05g，加水配制成IL培養(yǎng)液；
(2)、將培養(yǎng)液倒入玻璃瓶中；其有益效果是:把培養(yǎng)液進(jìn)行分裝，防止整批菌種感染雜菌影響生產(chǎn)進(jìn)度。
(3)、在培養(yǎng)液中放入攪拌子，用無(wú)菌透氣封口膜封口，滅菌；其有益效果是:攪拌子滅菌后配合磁力攪拌器培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種。
(4)、培養(yǎng)液冷卻至室溫，將蛹蟲草母種接種在培養(yǎng)液中；其有益效果是:操作簡(jiǎn)便，降低由于操作原因引起感染雜菌的幾率。
(5)、把接種后的培養(yǎng)液于培養(yǎng)室中20°C避光靜置24小時(shí)，然后放在磁力攪拌器上300轉(zhuǎn)/分鐘、暗培養(yǎng)3?5天。其有益效果是:使菌絲充分與培養(yǎng)液及空氣接觸，提高培養(yǎng)效率、節(jié)省空間。
本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果:
1.本發(fā)明申請(qǐng)人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，利用磁力攪拌生產(chǎn)蛹蟲草液體菌種可以大大縮短液體菌種的生產(chǎn)周期，由原來(lái)的6?7天縮短到3?5天。
2.相比搖床培養(yǎng)本發(fā)明可充分利用空間，在生產(chǎn)房間高度允許的情況下，配合支架擺放可放置5到7層，而搖床由于設(shè)備本身原因只能擺放I到2層。
3.相比搖床培養(yǎng)本發(fā)明生產(chǎn)量更大，每瓶一次可生產(chǎn)I?2L液體菌種。而搖床培養(yǎng)由于設(shè)備限制最大只能用500mL搖瓶，每瓶一次只可生產(chǎn)200?300mL液體菌種。
4.相比吹氣法培養(yǎng)本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、感染雜菌率底等優(yōu)點(diǎn)。
5.相比搖床培養(yǎng)和吹氣法培養(yǎng)，本發(fā)明外力對(duì)菌絲的攪拌更加直接，攪拌子在培養(yǎng)液內(nèi)對(duì)菌絲直接進(jìn)行攪拌，在不破壞菌絲生理結(jié)構(gòu)的前提下讓菌絲更加零散，相同時(shí)間內(nèi)菌絲繁殖的基數(shù)更大，可以使整瓶菌液的菌齡更加一致，生長(zhǎng)更加快速。
6.相比發(fā)酵罐培養(yǎng)，本發(fā)明投入小，利用空間更加充分，應(yīng)用更加方便、靈活，降低了滅菌難度和步驟，操作簡(jiǎn)單容易掌握。
【附圖說(shuō)明】
圖1不同培養(yǎng)天數(shù)菌絲生物量圖；
圖2不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速菌絲生物量圖；
圖3不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速菌絲生物量圖。
【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合附圖舉例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1:
為了確定本發(fā)明的最佳技術(shù)參數(shù)和驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，設(shè)計(jì)三組實(shí)驗(yàn)，具體方法如下: 一、利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定
1、培養(yǎng)液的配制
取土豆200g，去皮切塊加水煮熟，用8層紗布過(guò)濾土豆液，分別稱取葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、梓檬酸三錢lg、維生素B1 0.05g溶于土豆液，并加水定容至IL0
2、分裝
將配制好的培養(yǎng)液分裝至直徑12cm，高30cm的玻璃瓶中，IL/瓶。并在瓶中放入一顆5cm的攪拌子，用無(wú)菌透氣封口膜和橡皮筋封口，121°C滅菌20min。
3、接種
滅菌后待瓶中培養(yǎng)液冷卻至室溫，在超凈工作臺(tái)中將活化后的蛹蟲草母種接種在培養(yǎng)液中。
4、培養(yǎng)
把接種后的培養(yǎng)液置于培養(yǎng)室中20°C避光靜置24h，然后分別放在磁力攪拌器上600r/min避光培養(yǎng)，培養(yǎng)天數(shù)設(shè)置7個(gè)梯度，分別為:ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。
5、生物量測(cè)定
把培養(yǎng)后的液體菌種5000r/min離心棄上清液，加入清水，5000r/min離心棄上清液，重復(fù)兩次，把菌絲放入烘箱50°C烘干，稱重。計(jì)算不同梯度每瓶菌絲生物量的平均值如圖1o
結(jié)果:通過(guò)所得數(shù)據(jù)和觀察得出，第3天菌絲生物量達(dá)到最大值，第4天菌絲生物量比較穩(wěn)定，第5天有少量菌絲開始自溶，第6天時(shí)有大量菌絲自溶。因此認(rèn)定利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間為3d。
實(shí)施例2:
利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的確定
1、培養(yǎng)液的配制
取土豆200g，去皮切塊加水煮熟，用8層紗布過(guò)濾土豆液，分別稱取葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、梓檬酸三錢lg、維生素B1 0.05g溶于土豆液，并加水定容至IL0
2、分裝
將配制好的培養(yǎng)液分裝至直徑12cm，高30cm的玻璃瓶中，IL/瓶。并在瓶中放入一顆5cm的攪拌子，用無(wú)菌透氣封口膜和橡皮筋封口，121°C滅菌20min。
3、接種
滅菌后待瓶中培養(yǎng)液冷卻至室溫，在超凈工作臺(tái)中將活化后的蛹蟲草母種接種在培養(yǎng)液中。
4、培養(yǎng)
把接種后的培養(yǎng)液置于培養(yǎng)室中20°C避光靜置24h，然后分別放在磁力攪拌器上以不同轉(zhuǎn)速避光培養(yǎng)3d，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)置10梯度，分別為:100r/min、200r/min、300r/min、400r/min、500r/min、600r/min、700r/min、800r/min、900r/min、1000r/min，每個(gè)梯度設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。 5、生物量測(cè)定
把培養(yǎng)后的液體菌種5000r/min離心棄上清液，加入清水，5000r/min離心棄上清液，重復(fù)兩次，把菌絲放入烘箱50°C烘干，稱重。計(jì)算不同梯度每瓶菌絲生物量的平均值如圖2。
結(jié)果:通過(guò)所得數(shù)據(jù)和觀察得出，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為500r/min時(shí)生物量出現(xiàn)最大值，但300?600r/min之間無(wú)明顯差異，隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的提高，生物量逐漸下降，可能是轉(zhuǎn)速過(guò)快破壞了菌絲的生理結(jié)構(gòu)，考慮更好的保護(hù)菌絲的生理結(jié)構(gòu)，選擇300r/min為利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。
實(shí)施例3:
利用磁力攪拌與其他方法培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的對(duì)比試驗(yàn)
1、培養(yǎng)液的配制
取土豆200g，去皮切塊加水煮熟，用8層紗布過(guò)濾土豆液，分別稱取葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、梓檬酸三錢lg、維生素B1 0.05g溶于土豆液，并加水定容至IL0
2、分裝
將配制好的培養(yǎng)液分裝至直徑12cm，高30cm的玻璃瓶中，IL/瓶。并在用磁力攪拌方法培養(yǎng)瓶中放入一顆5cm的攪拌子。用無(wú)菌透氣封口膜和橡皮筋封口，121°C滅菌20min。
3、接種
滅菌后待瓶中培養(yǎng)液冷卻至室溫，在超凈工作臺(tái)中將活化后的蛹蟲草母種接種在培養(yǎng)液中。
4、培養(yǎng)
把接種后的培養(yǎng)液置于培養(yǎng)室中20°C避光靜置24h，然后分別用磁力攪拌、搖床、吹氣法三種方法培養(yǎng)，每個(gè)方法設(shè)3個(gè)重復(fù)。
5、生物量測(cè)定
把培養(yǎng)后的液體菌種5000r/min離心棄上清液，加入清水，5000r/min離心棄上清液，重復(fù)兩次，把菌絲放入烘箱50°C烘干，稱重。計(jì)算不同培養(yǎng)方法每瓶菌絲生物量的平均值如圖3所示。
結(jié)果:通過(guò)所得數(shù)據(jù)和觀察得出，在第三天時(shí)，應(yīng)用于培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的三種方法中，利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的生物量最高，為2.231g。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用磁力攪拌生產(chǎn)蛹蟲草液體菌種的方法，其特征在于，方法如下: (1)培養(yǎng)液的配制:土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂lg、檸檬酸三銨lg、維生素B10.05g，加水配制成IL培養(yǎng)液； (2)將培養(yǎng)液倒入玻璃瓶中: (3)在培養(yǎng)液中放入攪拌子，用無(wú)菌透氣封口膜封口，滅菌； (4)培養(yǎng)液冷卻至室溫，將蛹蟲草母種接種在培養(yǎng)液中； (5)把接種后的培養(yǎng)液于培養(yǎng)室中20°C避光靜置24小時(shí)，然后放在磁力攪拌器上300轉(zhuǎn)/分鐘、暗培養(yǎng)3?5天。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用磁力攪拌培養(yǎng)蛹蟲草液體菌種的方法。培養(yǎng)液的配制：土豆200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、檸檬酸三銨1g、維生素B1？0.05g，加水配制成1L培養(yǎng)液；將配制好的培養(yǎng)液倒入直徑12cm，高30cm的玻璃瓶中，放入一個(gè)5cm的攪拌子，用無(wú)菌透氣封口膜封口，121℃滅菌20min，待冷卻至室溫后在超凈工作臺(tái)中接種，接種后在磁力攪拌器上以300r/min培養(yǎng)3～5天。該方法制備蛹蟲草液體菌種菌絲生長(zhǎng)快、不染雜菌、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備占用空間小。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)蛹蟲草液體菌種制備方法的缺點(diǎn)，安全高效。
【IPC分類】C12R1/645, C12N1/14
【公開號(hào)】CN105087395
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510553269
【發(fā)明人】張國(guó)財(cái), 林連男, 張國(guó)珍, 鄒傳山, 趙博, 王婷玉, 畢冰, 趙金燕, 程功
【申請(qǐng)人】東北林業(yè)大學(xué), 張國(guó)財(cái)
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年8月27日