干細胞無血清培養(yǎng)基及干細胞的培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程技術領域，特別涉及干細胞無血清培養(yǎng)基及干細胞的培養(yǎng)方 法。
【背景技術】
[0002] 目前，在干細胞的常規(guī)培養(yǎng)體系中均加入了一定比例的動物血清，比較常用的是 胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子組成的極為復雜的混合物，它 對細胞在體外培養(yǎng)時的主要作用是提供生長因子、激素、結合蛋白，并提供保護作用。但它 也含有一些不利于細胞生長的抑制因子或毒性物質(zhì)，具有潛在的細胞毒性作用。血清中大 量成分復雜的蛋白質(zhì)，給細胞培養(yǎng)的標準化帶來困難，同時也給細胞培養(yǎng)表達產(chǎn)品分離純 化帶來很大的困難。而且動物血清可能存在動物攜帶的已知或未知病原體，對以后可能的 臨床應用構成威脅，對用于規(guī)模化培養(yǎng)細胞增加了難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術中利用動物血清培養(yǎng)干細胞存在一 定的毒性作用及病原體污染等缺陷，提供一種無毒性且無污染的干細胞無血清培養(yǎng)基。
[0004] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種干細胞無血清培養(yǎng)基，包括基 礎培養(yǎng)基，還包括胰島素、谷氨酰胺、含鐵的食品添加劑、和亞硒酸鈉、孕酮和丁二胺。
[0005] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，所述含鐵的食品添加劑包括轉鐵蛋白、 檸檬酸鐵、二甲胂酸鐵和葡糖酸鐵中一種或多種。
[0006] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，所述干細胞無血清培養(yǎng)基中，胰島素的 濃度為1-15yg/ml、谷氨酰胺的濃度為l-5mmol/l、含鐵的食品添加劑的濃度為20-200ng/ ml、亞硒酸鈉的濃度為20-50nmol/l、孕酮的濃度為5-30mmol/l和丁二胺的濃度為 10-100ymol/1〇
[0007] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，還包括還包括HEPES和青霉素。
[0008] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，所述HEPES的濃度為2-20mmol/l，青霉 素的濃度為l〇-l〇〇mg/ml。
[0009] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，還包括葡萄糖、NaHCO3、大豆胰酶抑制 劑、亞油酸和鏈霉素。
[0010] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，所述葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)為0. 1-1%， NaHCOj^濃度為l-10mm〇l/l，大豆胰酶抑制劑的質(zhì)量分數(shù)為0. 05-0. 2%，亞油酸的濃度為 10-100ymol/1，鏈霉素的濃度為 10-100mg/ml。
[0011] 在本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基中，所述基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0012] 本發(fā)明進一步提供一種干細胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0013] 獲取干細胞，采用上述的干細胞無血清培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。
[0014] 實施本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基及干細胞的培養(yǎng)方法，可以達到以下有益 效果：1、采用干細胞無血清培養(yǎng)基能夠避免現(xiàn)有技術中血清批次間的質(zhì)量差異，提高細胞 培養(yǎng)和試驗結果的重復性；2、可避免現(xiàn)有技術存在血清所帶來的外源性污染及血清組分的 細胞毒性作用；3、能夠避免不明的血清組分對細胞培養(yǎng)及試驗研究的影響；4、成份相對明 確、質(zhì)量一致且蛋白含量低，有利于提高細胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細胞產(chǎn)品易于純化；5、 能夠延長細胞的GI期或迫使細胞處于GO期而較長時間的維持細胞高密度培養(yǎng)，從而盡可 能的生產(chǎn)目的產(chǎn)物，并更好地保持干細胞的特性。
【具體實施方式】
[0015] 為解決現(xiàn)有技術中采用含有動物血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)干細胞血清組分存在易產(chǎn)生 毒性作用，并攜帶有病原體且細胞分離純化困難等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種干 細胞無血清培養(yǎng)基，通過在培養(yǎng)基中加入能夠替代血清的補充因子，從而實現(xiàn)了無污染培 養(yǎng)干細胞，提高細胞產(chǎn)品生產(chǎn)穩(wěn)定性的目的。
[0016] 本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基、胰島素、谷氨酰胺、含鐵的 食品添加劑、亞硒酸鈉、孕酮和丁二胺。
[0017]其中，基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖是細胞生長增殖以及產(chǎn)物表達過程中的重要能量來 源，優(yōu)選地，基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，該DMEM/F12培養(yǎng)基中含有極其豐富和復雜的 細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠支持多種類型細胞在無血清的培養(yǎng)基中生長。
[0018]胰島素能夠促進細胞利用葡萄糖和蛋白質(zhì)，促進RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑 制細胞凋亡，是非常重要的細胞存活因子；優(yōu)選地，干細胞無血清培養(yǎng)基中，胰島素的濃度 為 1-15yg/ml〇
[0019]谷氨酰胺脫掉氨基后，可作為培養(yǎng)細胞的能量來源，并參與蛋白質(zhì)的合成和核酸 代謝，促進細胞的生長增殖；優(yōu)選地，谷氨酰胺的濃度為l-5mmol/l。
[0020] 微量元素鐵是細胞生長增殖所必需的，含鐵的食品添加劑可以為轉鐵蛋白、檸檬 酸鐵、二甲胂酸鐵和葡糖酸鐵中的一種或多種；優(yōu)選地，含鐵的食品添加劑為轉鐵蛋白，因 為大多數(shù)哺乳動物細胞上均存在特定的轉鐵蛋白受體，轉鐵蛋白受體與轉鐵蛋白復合物結 合是細胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源，此外，轉鐵蛋白還具有生長因子的性質(zhì)并能 與其他微量元素如釩等結合，為細胞生長增殖提供必需的微量元素。優(yōu)選地，干細胞無血清 培養(yǎng)基中，含鐵的食品添加劑的濃度為20-200ng/ml。
[0021] 進一步地，在細胞培養(yǎng)過程中，基礎培養(yǎng)基中的酪氨酸、色氨酸、核黃素、抗壞血酸 鹽等會產(chǎn)生大量的過氧化氫，過氧化氫是細胞生長和克隆的主要毒性物質(zhì)，會引起細胞膜 上的飽和脂肪酸、細胞蛋白質(zhì)氧化和/或DNA損傷而導致細胞死亡。因此，在本發(fā)明提供的 干細胞無血清培養(yǎng)基中加入適量的亞硒酸鈉，亞硒酸鈉中的微量元素硒參與谷胱甘肽過氧 化物酶和過氧化物歧化酶的作用過程，從而能夠消除氧化物酶和氧自由基對細胞的傷害； 優(yōu)選地，該干細胞無血清培養(yǎng)基中，亞硒酸鈉的濃度為5-20nmol/l。
[0022] 孕酮能夠刺激細胞的增殖，且能夠促進細胞迀移，避免細胞貼壁生長造成的細胞 部分無法接觸到培養(yǎng)基的問題；優(yōu)選地，孕酮的濃度為5-30mmol/l。
[0023] 丁二胺作為細胞培養(yǎng)中的微量元素和低分子量營養(yǎng)因子，是細胞膜合成所需的 脂質(zhì)和細胞生長所需的水溶性脂質(zhì)，能夠促進細胞的生長增殖；優(yōu)選地，丁二胺的濃度為 10-100Umol/1〇
[0024] 綜上所述，本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基不僅可避免血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞所 造成的病原體污染，以及細胞分離純化等問題，而且能夠促進細胞的生長增殖。
[0025] 進一步地，本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基還包括青霉素，以及HEPES(中 文名：輕乙基哌嗪乙硫橫酸，2_[4_ (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，），這些物質(zhì)對于細胞的生長增殖均具有積極地促進輔助作用。
[0026] 其中，HEPES能夠補償培養(yǎng)基中無血清造成的緩沖能力下降，以維持細胞生長所需 的酸堿度，優(yōu)選地，ffiPES的濃度為2-20mmol/l;青霉素能夠阻礙細菌的細胞壁合成，導致 細胞泄漏死亡，從而抑制細菌的生長，優(yōu)選地，青霉素的濃度為10-lOOmg/ml。
[0027] 進一步地，本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基還包括葡萄糖、NaHCO3、大豆胰酶抑 制劑、亞油酸和鏈霉素。其中，葡萄糖是細胞生長增殖以及產(chǎn)物表達過程中的重要能量來 源，優(yōu)選地，葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)為〇.1-1%。NaHCO3用于當細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，調(diào)節(jié) 培養(yǎng)基的PH值至7. 2-7. 4,優(yōu)選地，NaHCOj^濃度為l-10mmol/l。大豆胰酶抑制劑在細胞 傳代過程中能夠終止胰蛋白酶消化細胞，達到保護細胞的目的，優(yōu)選地，大豆胰酶抑制劑的 質(zhì)量分數(shù)為〇.05-0. 2%。亞油酸作為細胞培養(yǎng)中的微量元素和低分子量營養(yǎng)因子，是細胞 膜合成所需的脂質(zhì)和細胞生長所需的水溶性脂質(zhì)，促進細胞生長；優(yōu)選地，亞油酸的濃度為 10-100ymol/1。鏈霉素能夠作用于細菌的核糖體，阻礙蛋白翻譯，從而抑制細菌生長；自然 環(huán)境下，不考慮人為產(chǎn)生的抗藥性，對青霉素不敏感的絕大多數(shù)微生物對鏈霉素敏感，反 之亦然；因此，本發(fā)明中將青霉素和鏈霉素搭配使用能夠控制幾乎全部常見的細菌；優(yōu)選 地，鏈霉素的濃度為l〇-l〇〇mg/ml。
[0028] 此外，許多細胞必須貼壁才能生長，而干細胞無血清培養(yǎng)基中，由于缺乏血清中的 各種粘附貼壁因子，細胞往往以懸浮形式生長，而不利于細胞增殖。因此，通過在干細胞無 血清培養(yǎng)基中加入促貼壁物質(zhì)來彌補這一缺陷，促貼壁物質(zhì)一般為細胞外基質(zhì)，可以是纖 粘連蛋白或層粘連蛋白等，同時，促貼壁物質(zhì)還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的 分化因子，對許多細胞的繁殖和分化起重要作用。優(yōu)選地，促貼壁物質(zhì)為纖連蛋白，主要促 進中胚層細胞的貼壁與分化；干細胞無血清培養(yǎng)基中，纖粘連蛋白或或層粘連蛋白的濃度 為0. 1-2yg/ml，具體可根據(jù)不同細胞的貼壁性，選擇性添加。
[0029] 本發(fā)明進一步提供一種干細胞的培養(yǎng)方法，在本實施例中，以間充質(zhì)干細胞為例， 當然本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基也可應用于其他類型的干細胞，本實施例間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng) 方法包括如下步驟：
[0030] 1)獲取間充質(zhì)干細胞；
[0031] 2)采用本發(fā)明提供的干細胞無血清培養(yǎng)基進行體外擴增培養(yǎng)。
[0032] 其中，步驟1)獲取間充質(zhì)干細胞的過程為：
[0033] 取人骸關節(jié)或下肢骨骨髓標本，肝素抗凝，按1:2的比例加在密度為I. 073g/ml 的peroll分離液上2300rpm離心30min，取中層單核細胞，加入PBS緩沖液，1000 rpm離心 l〇min，洗滌3次，棄上清液。所得原代間充質(zhì)干細胞在光學顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整至IXIO7個 /培養(yǎng)瓶（25ml)密度用DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0034] 可以理解的是，以上僅為本發(fā)明提供的其中一種獲取間充質(zhì)干細胞的途徑，現(xiàn)有 技術中，間充質(zhì)干細胞的獲取方式同樣適用于本發(fā)明。