外，本發(fā)明提供的一種與下游配體-感應(yīng)性刺激子結(jié)合時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同調(diào) 節(jié)-IPRF的獨(dú)特方法。通過理性的重新設(shè)計(jì)減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以及將有效刺激子置換成較 弱的配體-感應(yīng)性刺激子來增加調(diào)節(jié)性動(dòng)力學(xué)范圍，也可提供一種進(jìn)一步改善調(diào)節(jié)翻譯效 率的平臺。
【附圖說明】
[0020] 圖IA為一意示圖顯示，位于滑動(dòng)點(diǎn)上游的穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及下游假結(jié)刺激子，對 于-1程序性核糖體移碼活性具有相反的作用，其中上游的發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成可以受到鄰近的 配體-敏感性RNA元件所調(diào)節(jié)。
[0021] 圖IB顯示一些可使用作為調(diào)控移碼位點(diǎn)上游雙螺旋結(jié)構(gòu)形成（經(jīng)再折疊形成發(fā) 夾結(jié)構(gòu)主干或由反義序列介導(dǎo)的雙螺旋結(jié)構(gòu)形成）的可能配體。
[0022] 圖2為一模型顯示，RNA構(gòu)形動(dòng)力學(xué)及RNA-配體復(fù)合體形成都受到至少四個(gè)不同 階段的翻譯延長階段中的核糖體所調(diào)控。
[0023] 圖3A為顯示針對由RNA-蛋白質(zhì)交互作用所介導(dǎo)，分別在GlcT-OFF及GlcT-ON RNA元件中的-IPRF減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)破壞及促成作用的序列設(shè)計(jì)與說明。Mfold用于預(yù)測 該減弱子及反-減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)的構(gòu)造與自由能。
[0024] 圖3B為顯示使用帶有下游DU177假結(jié)刺激子與上游GlcT-OFF或GlcT-ON元件的 經(jīng)截短的p21uc報(bào)告基因在逐漸增加GlcTRBD用量情況下，進(jìn)行網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞溶解產(chǎn)物 中的活體外放射性-IPRF活性分析。
[0025] 圖3C為顯示在不同劑量的GlcTRBD存在下，圖3B所述的報(bào)告基因構(gòu)體的相 對-IPRF活性，其中設(shè)定不含GlcTRBD組的活性測試值為1 (以灰色表示）。
[0026] 圖4A為顯示theo-OFFl、theo-mOFFl及theo_0FF2的序列、預(yù)測結(jié)構(gòu)與自由能。 加框區(qū)的核苷酸在陰性對照組theo-mOFFl元件中被刪除。
[0027] 圖4B顯示使用帶有下游DU177假結(jié)刺激子與上游theo-OFFl或theo_0FF2元件 的經(jīng)截短的p21uc報(bào)告基因在逐漸增加茶堿用量情況下，進(jìn)行網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞溶解產(chǎn)物中 的體外放射性-IPRF活性分析。
[0028] 圖4C顯示在不同劑量的茶堿存在下，圖4B所述的報(bào)告基因構(gòu)體相較于無添加茶 堿的構(gòu)體活性（以灰色表示）的-IPRF活性相對倍數(shù)變化。
[0029] 圖5A為顯示的theo-ON序列、預(yù)測結(jié)構(gòu)及自由能。
[0030] 圖5B顯示使用帶有下游DU177假結(jié)刺激子與上游theo-ON元件的經(jīng)截短的p21uc 報(bào)告基因在逐漸增加茶堿用量情況下，進(jìn)行網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的活體外放射 性-IPRF活性分析。
[0031] 圖5C顯示在不同劑量的茶堿存在下，圖5B所述的報(bào)告基因構(gòu)體相較于無添加茶 堿的構(gòu)體活性（以灰色表示）的-IPRF活性相對倍數(shù)變化。
[0032] 圖6A顯示使用帶有下游DU177假結(jié)刺激子與上游the〇-0FF2元件或控制組的 p21uc報(bào)告基因在逐漸增加茶堿用量情況下，使用小麥胚芽提取物作為體外翻譯系統(tǒng)進(jìn)行 體外放射性-IPRF活性分析。
[0033] 圖6B為顯示在不同劑量的茶堿存在下，圖6A所述的報(bào)告基因構(gòu)體相較于無添加 茶堿的構(gòu)體活性（以灰色表示）的-IPRF活性相對倍數(shù)變化。
[0034] 圖7A顯示上游theo-OFF元件與具SAH-依賴性的-IPRF刺激子共同作用，在293T 細(xì)胞中作為一種雙-輸入邏輯閘。
[0035]圖7B為顯示在不同含量的茶堿及Adox(腺苷-2'，3'二醛，一種阻斷SAH水解而 增進(jìn)細(xì)胞內(nèi)SAH濃度的細(xì)胞-可穿透性AdoHcy水解酶抑制劑）存在下，通過帶有SAH-感 應(yīng)性假結(jié)刺激子與上游the〇-0FF2元件的全長報(bào)告基因所轉(zhuǎn)感染的293T細(xì)胞的相對-IPRF 活性。無添加茶堿及Adox的構(gòu)體活性值設(shè)定為1(以灰色表示）。本結(jié)果從在293T細(xì)胞 (通過不同-IPRF構(gòu)體轉(zhuǎn)感染）測量得的雙-熒光酶活性，計(jì)算出-IPRF活性。
[0036] 圖8A顯示使用經(jīng)剪接Venus的N-及C-端部分，分別追蹤0-與-1框架表達(dá)的流 程圖。
[0037] 圖8B顯示通過帶有上游theo_0FF2元件，與位于連結(jié)區(qū)下游的SAH-感應(yīng)性假結(jié) 的PN插入C-Venus-IPRF報(bào)告基因所轉(zhuǎn)感染的293T細(xì)胞，在不同含量的茶堿及Adox存在 下的熒光顯微鏡影像（尺規(guī)橫線為10ym)。圖8C顯示得自通過圖8B所述的-IPRF報(bào)告基 因轉(zhuǎn)感染的293T細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot)分析結(jié)果。
[0038] 圖9A顯示使用帶有SAH-感應(yīng)性假結(jié)與上游the〇-0FF2 (右列）或?qū)φ战M元件（左 列）的p21uc報(bào)告基因在不同含量的茶堿及SAH存在下，使用小麥胚芽抽出物作為體外翻 譯系統(tǒng)進(jìn)行的體外放射性-IPRF活性分析。
[0039] 圖9B為顯示在不同含量的茶堿及SAH存在下，缺乏the〇-0FF2元件的報(bào)告基因構(gòu) 體相較于無添加配體的報(bào)告基因構(gòu)體活性（以灰色表示）的-IPRF活性相對倍數(shù)變化。
[0040] 圖9C顯示在不同含量的茶堿及SAH存在下，帶有theo_0FF2元件的報(bào)告基因構(gòu)體 相較于無添加配體的報(bào)告基因構(gòu)體活性（以灰色表示）的-IPRF活性相對倍數(shù)變化。
[0041] 圖10A顯示位于所使用構(gòu)體中緊鄰-IPRF滑動(dòng)點(diǎn)上游的發(fā)夾結(jié)構(gòu)-形成序列，及 所設(shè)計(jì)的反義DNA阻斷物的示意圖。構(gòu)體中的標(biāo)靶序列以畫底線表示，對應(yīng)于-IPRF減弱 子發(fā)夾結(jié)構(gòu)主干（6BPGC)的5'-及3'-半部序列以粗體字表示，而反義阻斷物的序列以小 寫字體表示。
[0042] 圖10B顯示含有6BPGC的報(bào)告基因在相對應(yīng)反義DNA阻斷物存在下，進(jìn)行-IPRF 分析的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。圖中標(biāo)示出DNA阻斷物及對應(yīng)于O框架與-1框架產(chǎn)物的 翻譯蛋白質(zhì)的濃度。圖IOC顯示在相對應(yīng)反義阻斷物存在下，含有6BPGC的報(bào)告基因的相 對移碼活性，其中僅含報(bào)告基因組的移碼效率為設(shè)定為100% (以灰色表示）。
[0043] 圖IIA顯示位于所使用構(gòu)體中緊鄰-IPRF滑動(dòng)點(diǎn)上游的序列，及所設(shè)計(jì)的反義DNA 寡核苷酸的示意圖。構(gòu)體中的標(biāo)靶上游序列（6BPGC5'WT)以畫底線表示，而反義寡核苷酸 的序列以小與字體表不。
[0044] 圖IlB顯示在含有6BPGC5'-WT的報(bào)告基因在相對應(yīng)反義DNA寡核苷酸存在下，進(jìn) 行-IPRF分析的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。圖中標(biāo)示出DNA寡核苷酸及對應(yīng)于0框架與-1 框架產(chǎn)物的翻譯蛋白質(zhì)的濃度。
[0045] 圖IlC顯示在相對應(yīng)反義寡核苷酸存在下，含有6BPGC5'-WT的報(bào)告基因的相對移 碼活性，其中僅含報(bào)告基因組的移碼效率為設(shè)定為100% (以灰色表示）。
[0046] 圖12A顯示由反義DNA所介導(dǎo)的上游雙螺旋結(jié)構(gòu)對于-IPRF減弱效率所產(chǎn)生的距 離效應(yīng)。圖12A中列示所使用的反義DNA，及所形成DNA-RNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測自由能。由 Tl-O寡核苷酸所介導(dǎo)的雙螺旋結(jié)構(gòu)與UUUAAAC滑動(dòng)點(diǎn)之間無核苷酸存在，而由Tl-I寡核苷 酸所介導(dǎo)的雙螺旋結(jié)構(gòu)與該滑動(dòng)點(diǎn)之間存在1個(gè)核苷酸空間，以此類推。
[0047] 圖12B顯示在反義序列所介導(dǎo)的上游DNA-RNA雙螺旋結(jié)構(gòu)存在下，隨著與移碼位 點(diǎn)的距離所產(chǎn)生的相對-IPRF移碼效率。結(jié)果表示，穩(wěn)定的上游雙螺旋結(jié)構(gòu)必需靠近移碼 位點(diǎn)，才能作為有效的-IPRF減弱子。
[0048] 圖13A顯示涵蓋West-Nile病毒（WNV)的NS2A基因的-IPRF信號的序列 (Melian，E.B.等人，J.Viorl. 84, 1641-1647, 2010)，將具有所預(yù)測刺激子假結(jié)構(gòu)造的序列 插入到p21uc-lPRF報(bào)告基因中。圖中，由抗-WNV反義DNA阻斷物靶定的上游WNV病毒序 列以粗體字表示，滑動(dòng)點(diǎn)以畫底線表示，而反義DNA阻斷物的序列以小寫字體表示。
[0049] 圖13B顯示在不同含量的抗-WNVDNA及對照組寡核苷酸存在下，p21uc-WNV-lPRF 報(bào)告基因的相對移碼活性，其中僅含報(bào)告基因組的移碼效率為設(shè)定為100% (以灰色表 示），此結(jié)果為根據(jù)雙-熒光酶分析測定網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的體外-IPRF活性進(jìn)行 比較。誤差線段為值s.d.;n= 3。
[0050] 圖14A顯示含有上游元件及隨后接有酵母菌+1移碼位點(diǎn)的酵母菌p21uc-lPRF報(bào) 告基因構(gòu)體的示意圖。注意，上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)在此是作用為+1移碼刺激子，而添加茶堿破壞 上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會(huì)導(dǎo)致減量調(diào)節(jié)+1移碼活性。
[0051] 圖14B顯示在不同含量的茶堿及咖啡