Sail與BamHI限制切位（以粗體字表示），其可針對(duì)插入于熒光-IPRF報(bào) 告基因中的，移碼元件提供插入部位。然后將兩段經(jīng)擴(kuò)增的基因片段以使用Fl及R2引物 進(jìn)行的PCR接合方法融合，而產(chǎn)生一種具有插入部位的連接序列（用于將對(duì)應(yīng)于原始Venus ORF的殘基174與175的核苷酸序列連接）的復(fù)合式基因片段。接著使用該已插入連接序 列的Venus片段取代pNPY-Venus-Nl中的原始Venus，而產(chǎn)生載體pNinsertC-Venus。
[0077]R2:5,-TGATCTAGAGTCGCGGCCGCT-3'（SEQIDN0:4)
[0078] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在茶堿與Adox二者共同存在時(shí)，可觀察到顯著的Venus熒光活性，如圖 8B及圖8C所示。因此，上述實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)通過使用可調(diào)節(jié)具有兩種在-IPRF中扮演相反角 色的RNA基序的RNA結(jié)構(gòu)的小分子配體來調(diào)節(jié)-IPRF作用，具有建構(gòu)一種雙-輸入邏輯閘 的潛能。
[0079] 本發(fā)明也將theo_0FF2與一種具有SAH-依賴性的-IPRF刺激子融合，并使用小麥 胚芽溶解產(chǎn)物檢驗(yàn)活體外-IPRF活性的配體-依賴性。無添加茶堿及SAH時(shí)，-IPRF活性 幾近于背景值，而僅添加茶堿或Adox，-1移碼效率只有些微增加。相反地，同時(shí)添加茶堿及 SAH可協(xié)同地增進(jìn)-1移碼效率（圖9)。
[0080] 設(shè)計(jì)用于靶定上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)主干進(jìn)行-IPRF移碼活性調(diào)節(jié)的反義DNA寡核苷酸
[0081] 本實(shí)例設(shè)計(jì)具有與有效減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)（6BPGC)主干（參見圖10A)的5' -半部 或3' -半部序列互補(bǔ)的序列的DNA寡核苷酸（6BPGC-5' -DNA或6BPGC-3' -DNA)，使其作為 一種調(diào)節(jié)性配體，并進(jìn)一步測(cè)量彼等對(duì)于含有該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的-IPRF報(bào)告基因的減弱效率的 影響。有趣的是，添加6BPGC-5' -DNA會(huì)導(dǎo)致6BPGC減弱子活性以劑量-依賴形式流失，而 添加6BPGC-3'-DNA則絲毫不會(huì)抑制減弱子活性（圖10AU0B及10C)。基于與移碼位點(diǎn)接 近度對(duì)于順式作用的減弱子發(fā)夾的減弱效率的關(guān)鍵作用（參見Cho，C.P.等人，PLoSONE 8,e62283, 2013)，這種差異可能是由于所形成的兩個(gè)RNA-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)與移碼位點(diǎn)之間 的距離不同所造成的。
[0082] 上游近端雙螺旋結(jié)構(gòu)作為-IPRF減弱作用的功能性單位以及上游雙螺旋結(jié)構(gòu)對(duì) 于-IPRF減弱效率的距離效應(yīng)
[0083] 添加具有與缺陷減弱子6BPGC5'-WT的3'端-元件互補(bǔ)的序列的反義DNA(圖IlA 所示的回復(fù)DNA)，會(huì)導(dǎo)致含有6BPGC5'-WT的報(bào)告基因的-1移碼效率以劑量-依賴形式減 弱（圖IlAUlB及11C)，表示上游的反式雙螺旋結(jié)構(gòu)也能夠減弱-1PRF。這些數(shù)據(jù)也顯示， 上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)在共-翻譯發(fā)夾結(jié)構(gòu)再折疊過程中重新形成的主干，對(duì)于閱讀框改變的調(diào)節(jié) 作用而言為功能性決定因子。
[0084] 圖12列示與缺陷-IPRF減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)（6BPGC-5'WT)的序列互補(bǔ)的反義DNA， 以及其在使用網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行的活體外-IPRF分析測(cè)定相對(duì)移碼活性所得 的分析結(jié)果。如該圖的結(jié)果所示，減弱效率是由雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，及其與滑動(dòng)點(diǎn)之間的 距離來決定。
[0085] 由反義_介導(dǎo)產(chǎn)生的上游雙螺旋結(jié)構(gòu)可提供一種另類抑制-IPRF依賴型病毒病原 的方法
[0086] 基于本發(fā)明上述的研究發(fā)現(xiàn)，遂設(shè)計(jì)一種用來靶定West-Nile病毒（WNV)NS2A基 因的-IPRF移碼位點(diǎn)上游序列的反義DNA，并與一無關(guān)的寡核苷酸比較其-IPRF抑制功效。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此類反義策略可有效減低含有WN病毒序列的報(bào)告基因的-IPRF活性，而無關(guān)的 寡核苷酸則不具有此活性（圖13)。
[0087] 通過上游theo_0FF2元件對(duì)于上游+IPRF刺激子發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的茶堿-依賴性調(diào) 控來減量調(diào)節(jié)酵母菌系統(tǒng)中的+IPRF
[0088] 使用CUUUGG序列作為可能的+1移碼位點(diǎn)來取代酵母菌的自然CUUAGG+1移碼序 列。然后將圖4中所設(shè)計(jì)的the〇-0FF2元件置于該CUUUGG序列的上游。當(dāng)茶堿與茶堿適 體序列結(jié)合時(shí)，應(yīng)該會(huì)造成移碼位點(diǎn)上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，由于該上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)是一種+1 移碼刺激子，而非作為圖4所示的-IPRF減弱子，表示添加茶堿導(dǎo)致的+IPRF減量調(diào)節(jié)（圖 14) 〇
[0089] 根據(jù)圖IB的概述，本發(fā)明已揭露可能用于調(diào)節(jié)上游-IPRF減弱子或+IPRF刺激子 的配體的概念、設(shè)計(jì)及應(yīng)用，以期能夠探究代謝物-核糖開關(guān)交互作用參與真核細(xì)胞（包 括植物與哺乳動(dòng)物細(xì)胞）翻譯調(diào)節(jié)的機(jī)制。值得注意的是，本發(fā)明已證實(shí)共-翻譯再折疊 RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)對(duì)于核糖體閱讀框改變調(diào)控的配體-依賴性調(diào)節(jié)潛能，可從旁避開對(duì)于尋找 配體-感應(yīng)性假結(jié)的需求。
[0090] 此外，本發(fā)明提供一種與下游配體-感應(yīng)性刺激子結(jié)合時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同調(diào)節(jié)-IPRF 的獨(dú)特方法。通過理性的重新設(shè)計(jì)減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以及將有效刺激子置換成較弱的配 體-感應(yīng)性刺激子（參見圖4、6及7)來增加調(diào)節(jié)性動(dòng)力學(xué)范圍，也可提供一種進(jìn)一步改善 調(diào)節(jié)翻譯效率的平臺(tái)。
[0091] 其他【具體實(shí)施方式】
[0092] 雖然本發(fā)明已描述其有限的具體實(shí)施例，但是在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域可借助于本 說明書的揭示而了解，在不偏離本說明書所揭露的范圍下，可衍生出其他實(shí)施方式。于是， 本發(fā)明的范圍應(yīng)受限于所附的權(quán)利要求書。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于調(diào)節(jié)真核細(xì)胞基因表達(dá)的組成物，其特征在于，包含一種用于調(diào)節(jié)程序性 核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的配體分子。2. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述真核細(xì)胞為植物細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述程序性核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性 發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的調(diào)節(jié)作用包括促進(jìn)所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成。5. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述程序性核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性 發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的調(diào)節(jié)作用包括抑制所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成。6. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述程序性核糖體移碼為-1程序性核糖 體移碼。7. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述程序性核糖體移碼為+1程序性核糖 體移碼。8. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述配體為一種與所述受調(diào)芐基因的 mRNA中的程序性核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列結(jié)合的分子。9. 如權(quán)利要求1所述的組成物，其特征在于，所述配體為一種與所述受調(diào)芐基因的 mRNA中的程序性核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列互補(bǔ)的反義序列。10. 如權(quán)利要求8所述的組成物，其特征在于，所述配體為一種與所述受調(diào)芐基因的 mRNA中的程序性核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列結(jié)合的RNA-結(jié)合蛋白。11. 如權(quán)利要求8所述的組成物，其特征在于，所述配體為一種與所述受調(diào)芐基因的 mRNA中的程序性核糖體移碼位點(diǎn)上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列結(jié)合的有機(jī)化合物。12. -種用于活體外調(diào)節(jié)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯作用的核糖體移碼效率的方法，包含將 真核細(xì)胞與如權(quán)利要求1所述的組成物接觸，以使所述組成物中包含的配體分子抑制或增 進(jìn)核糖體移碼位點(diǎn)的上游調(diào)節(jié)性雙螺旋結(jié)構(gòu)元件形成。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述真核細(xì)胞為植物細(xì)胞。14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。15. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述配體分子為一種RNA-結(jié)合蛋白。16. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述配體分子為一種有機(jī)化合物。17. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述配體分子為一種反義序列。
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于一種利用配體-敏感性RNA因子調(diào)節(jié)程序性核糖體移碼位點(diǎn)(PRF？site)上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，來達(dá)到調(diào)控真核基因表達(dá)的方法。進(jìn)而，本發(fā)明關(guān)于一種調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯過程中核糖體移碼效率的方法，包含將真核細(xì)胞與一種可用于控制程序性核糖體移碼位點(diǎn)(PRF？site)上游雙螺旋調(diào)控結(jié)構(gòu)形成的分子接觸。本發(fā)明的方法不涉及由核糖核酸酶H(RNase？H)或核糖核酸干擾(RNAi)所引起的信使核糖核酸降解。
【IPC分類】C12N15/113
【公開號(hào)】CN105087577
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510223428
【發(fā)明人】張功耀, 卓哲霈, 許琇婷, 林雅惠
【申請(qǐng)人】李德財(cái)
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年5月5日
【公告號(hào)】US20150322403