一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的ssr分子標(biāo)記試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記檢測(cè)試劑盒，特別是涉及一種玉米品種東單60純度檢 測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是我國(guó)的重要作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。玉米種子質(zhì)量直接影響產(chǎn) 量，玉米種子純度是評(píng)價(jià)種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。實(shí)踐中，我國(guó)玉米種子純度鑒定仍以籽粒形 態(tài)鑒定、幼苗鑒定和田間小區(qū)種植鑒定為主體，輔以同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)。
[0003] 利用種子、幼苗或者株型等形態(tài)差異鑒定純度的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、受環(huán)境和基因顯 隱性等的影響較大，檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)偏差。同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、成本 低等優(yōu)點(diǎn)，然而，而且隨著玉米品種的數(shù)量逐年增多，種質(zhì)資源狹窄，同質(zhì)化問(wèn)題愈顯突出， 難以找到雜交種特征帶，難以進(jìn)行有效的品種純度檢測(cè)。
[0004] 利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)玉米品種純度鑒定的優(yōu)越性在于：（I)SSR分子標(biāo)記數(shù)量 大，特異性高，可鑒定表型難于鑒別的品種；（2)SSR分子標(biāo)記不受任何環(huán)境因素的影響，可 在生長(zhǎng)發(fā)育的任何階段取材鑒定；（3)SSR分子標(biāo)記呈共顯性遺傳，操作靈活、簡(jiǎn)便、快速， 易于分析；（4)利用SSR分子標(biāo)記鑒定品種，不僅準(zhǔn)確可靠，而且還便于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。
[0005] 玉米品種東單60是遼寧東亞種子科學(xué)研究院于2001年遼寧省審定的品種，遼審 玉[2001] 132號(hào)，以A801為母本，以ClOl為父本組配而成的。株高290厘米，穗位128厘 米，穗長(zhǎng)19. 8厘米，株型較緊湊，籽粒黃色，馬齒型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，用 以檢測(cè)玉米品種東單60的純度，本試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以及時(shí)準(zhǔn)確的檢 測(cè)出純度結(jié)果，能夠減少假劣種子坑農(nóng)害農(nóng)案件的發(fā)生，保證糧食種植安全。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，以玉米品種東單60及父母本 雙親的基因組DNA為模板，通過(guò)對(duì)覆蓋全基因組200對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得兩對(duì)雙親互 補(bǔ)特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定的SSR引物，SEQIDNO:1和2和SEQIDNO:3和4。
[0008]SEQIDNO:1 序列（5, 一 3'）GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG SEQIDNO:2 序列（5, 一 3'）CACGTACGGCAATGCAGACAAG SEQIDNO:3 序列（5, - 3,）GATCCGCATTGTCAAATGACCAC SEQIDNO:4 序列（5, 一 3'）AGGACACGCCATCGTCATCA 所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)SSR分子標(biāo)記試劑盒，以玉米品種東單60的基 因組DNA為模板，以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4為SSR特異性引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
[0009] 所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)SSR分子標(biāo)記試劑盒，PCR反應(yīng)體系總體積 201^，包括14.11^超純水、21^10倍卩〇?緩沖液、1.21^(1犯1^(2.5臟〇1/1)、0.51^ 35尺引物（0.254111〇1/1)、0.21^71叫0嫩聚合酶（2.51]/1^)、21^0嫩，混勻。
[0010] 所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)SSR分子標(biāo)記試劑盒，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變 性 5min;94°C變性 40s，60°C退火 35s，72°C延伸 45s，循環(huán) 35 次；72°C延伸 5min;4°C保存。
[0011] 所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，純度結(jié)果通過(guò)帶型 統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子粒數(shù)的百分率表示。
[0012] 試劑盒中還可包括抽提樣品DNA所需的各種試劑。這些試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員周 知的。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果是： 1.本發(fā)明在對(duì)覆蓋玉米全基因組的200對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得兩對(duì)雙親互補(bǔ)特異 性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定的SSR引物，由其兩對(duì)特異性引物和7?濟(jì)每等試劑開(kāi)發(fā)出針對(duì)玉 米品種東單60純度檢測(cè)的試劑盒，可以快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)出玉米品種東單60的純度， 為品種管理和市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐，還對(duì)保證糧食種植安全具有一定的指導(dǎo)意義。
[0014] 2.本發(fā)明的試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)出純度結(jié) 果，能夠減少假劣種子坑農(nóng)害農(nóng)案件的發(fā)生，保證糧食種植安全。
[0015] 3.本發(fā)明的試劑盒可為品種管理和市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為本發(fā)明的SEQIDNO:1和2擴(kuò)增玉米品種東單60及父母本結(jié)果圖； 圖2為本發(fā)明的SEQIDNO:3和4擴(kuò)增玉米品種東單60及父母本結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0018] 本發(fā)明的檢測(cè)過(guò)程為： (1)玉米品種東單60基因組DNA提取隨機(jī)數(shù)取100粒種子，采取CTAB法進(jìn)行DAN提 取。
[0019] (2)PCR擴(kuò)增以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4為SSR特異性引物，配制 20ulPCR反應(yīng)體系。
[0020] (3)PCR反應(yīng)體系總體積20yL，包括14.IyL超純水、2yL10倍PCR緩沖液、 1.21^(1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?特異性引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混勻。
[0021] (4)反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 環(huán)35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0022] (5)電泳檢測(cè)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。
[0023] (6)純度結(jié)果通過(guò)帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子 粒數(shù)的百分率表示。
[0024] 實(shí)施例1 本實(shí)施例中用玉米品種東單60純度檢測(cè)SSR分子標(biāo)記試劑盒，檢測(cè)玉米品種東單60 樣品A的純度。操作流程如下： 1)隨機(jī)數(shù)取玉米品種東單60樣品AlOO粒種子，采取CTAB法進(jìn)行DAN提取。
[0025] (2)PCR擴(kuò)增以SEQIDNO:1和2為SSR特異性引物，配制20ulPCR反應(yīng)體系。
[0026] (3)PCR反應(yīng)體系總體積20yL，包括14.IyL超純水、2yL10倍PCR緩沖液、 1.21^(1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?特異性引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混勻。
[0027] (4)反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 環(huán)35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0028] (5)電泳檢測(cè)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。
[0029] (6)純度結(jié)果通過(guò)帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子 粒數(shù)的百分率表示。
[0030] 具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)為93,按公式：
玉米品種東單60樣品A純度為=93/100=93%。
[0031] 實(shí)施例2 本實(shí)施例中用玉米品種東單60純度檢測(cè)SSR分子標(biāo)記試劑盒，檢測(cè)玉米品種東單60 樣品B的純度。操作流程如下： 1)隨機(jī)數(shù)取玉米品種東單60樣品BlOO粒種子，采取CTAB法進(jìn)行DAN提取。
[0032] (2)PCR擴(kuò)增以SEQIDNO:3和4為SSR特異性引物，配制20ulPCR反應(yīng)體系。
[0033] (3)PCR反應(yīng)體系總體積20yL，包括14.IyL超純水、2yL10倍PCR緩沖液、 1.21^(1贈(zèng)8(2.5臟〇1/1)、0.5卩1^51?特異性引物（0.25卩111〇1/1)、0.2卩1^&9 0熟聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混勻。
[0034] (4)反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 環(huán)35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0035] (5)電泳檢測(cè)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。
[0036] (6)純度結(jié)果通過(guò)帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子 粒數(shù)的百分率表示。
[0037] 具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)為96,按公式：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含 有2對(duì)雙親互補(bǔ)特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定的SSR引物：SEQ ID NO :1和2和SEQ ID NO: 3 和 4 ;； SEQ ID NO :1 序列（5, 一 3'）GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG ; SEQ ID NO :2 序列（5, 一 3'）CACGTACGGCAATGCAGACAAG ; SEQ ID NO :3 序列（5, - 3'）GATCCGCATTGTCAAATGACCAC ; SEQ ID NO :4 序列（5, 一 3'）AGGACACGCCATCGTCATCA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，其特 征在于，以玉米品種東單60的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO :1和2或SEQ ID NO :3和 4為SSR特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，其特 征在于，PCR反應(yīng)體系總體積20 y L，包括14. I y L超純水、2 y L 10倍PCR緩沖液、I. 2 y L dNTPs(2. 5mmol/L)、0. 5 y L SSR 引物（0? 25 ymol/L)、0. 2 y L DNA 聚合酶（2. 5U/y L)、 2yL DNA，混勻。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，其特 征在于，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循環(huán)35 次；72°C延伸5min ;4°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，其特 征在于，純度結(jié)果通過(guò)帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子粒數(shù) 的百分率表示。
【專利摘要】一種玉米品種東單60純度檢測(cè)的SSR分子標(biāo)記試劑盒，涉及一種分子標(biāo)記檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明利用父母本雙親互補(bǔ)特異性SSR引物對(duì)玉米品種東單60進(jìn)行純度檢測(cè)。以玉米品種東單60及父母本雙親的基因組DNA為模板，通過(guò)對(duì)覆蓋全基因組200對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得兩對(duì)雙親互補(bǔ)特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定的SSR引物，由其兩對(duì)特異性引物和<i>Taq</i>酶等試劑開(kāi)發(fā)出針對(duì)玉米品種東單60純度檢測(cè)的試劑盒。該試劑盒的開(kāi)發(fā)，不僅可以快速評(píng)價(jià)玉米純度質(zhì)量，為品種管理和市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐，還對(duì)提高種子產(chǎn)業(yè)整體質(zhì)量水平，保證糧食種植安全具有一定的指導(dǎo)意義。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105087784
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510449540
【發(fā)明人】岳靜, 朱志成, 楊雙
【申請(qǐng)人】沈陽(yáng)化工大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日