用于辣椒品種匯豐2號種子純度鑒定的ssr引物組及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子標記技術，具體涉及利用SSR分子標記檢測辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的引物組及方法。
【背景技術】
[0002]‘匯豐2號’是一個雜交一代辣椒品種，中早熟，具有耐貯運，品質(zhì)佳等特性，同時抗疫病并且耐熱、耐寒、耐澇和耐旱能力強，深受消費者和戶喜愛(王恒明，李穎，郭漢權，等.早中熟優(yōu)質(zhì)辣椒新品種‘匯豐2號’ [J].園藝學報，2010，02期:337-338.)。由于辣椒是一種常見的異花授粉作物，以自交為主，同時存在一定的天然雜交(〈50%)。因此在h制種時即使是其他方法制種(如雄性不育的利用)，也需要人工輔助授粉。在？1代雜交種制種過程中由于生物學混雜和人工操作混雜等原因造成雜交種純度降低的現(xiàn)象時有發(fā)生，給種子生產(chǎn)者、經(jīng)營者和農(nóng)戶造成巨大經(jīng)濟損失。因此，在制種后和銷售前對辣椒h代雜種子進行純度鑒定是必不可少的。
[0003]目前辣椒種子純度鑒定通常采用田間小區(qū)種植，以形態(tài)觀察的辦法，但由于辣椒生育期長，形態(tài)學鑒定通常需要60-120天，周期長，受環(huán)境影響大，準確性較低且耗費人力、財力，所以其應用受到限制。隨著分子生物技術的迅猛發(fā)展，使從DNA水平準確、可靠地對種子純度進行鑒定成為現(xiàn)實。簡單序列重復(Simple Sequence Repeat，SSR)是一類廣泛分布于基因組上的DNA序列，根據(jù)其在不同材料間產(chǎn)生不同的重復次數(shù)從而產(chǎn)生多態(tài)SSR標記。SSR標記是一種共顯性標記，具有多態(tài)性好、重復性高、操作簡便等優(yōu)點，被認為是一種發(fā)展前景看好的DNA指紋技術，目前已廣泛運用于水稻、玉米等作物種子純度鑒定，隨著其它小作物基因組學的迅速發(fā)展，利用SSR分子標記檢測種子純度的方法也在黃瓜、甘藍等蔬菜作物中得以應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的SSR分子標記、SSR引物組及方法。
[0005]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的SSR分子標記L0143，其定位于辣椒第1號染色體上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分別為141bp和149bp。
[0006]優(yōu)選的，所述SSR分子標記L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]用于PCR擴增上述SSR分子標記L0143的引物對。
[0008]優(yōu)選的，用于PCR擴增SSR分子標記L0143的引物對，其序列如下所示:
L0143F:ATGGAGCACCATACTCAAACAACC (SEQ ID N0.3)；
L0143R:GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG (SEQ ID N0.4)。
[0009]一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的SSR分子標記L0622，其定位于辣椒第6號染色體上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分別為196bp和208bp。
[0010]優(yōu)選的，所述SSR分子標記L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0011]用于PCR擴增上述SSR分子標記L0622的引物對。
[0012]優(yōu)選的，用于PCR擴增SSR分子標記L0622的引物對，其序列如下所示:
L0622F:GCTCATCAACCCACCTTCATCA (SEQ ID N0.7)；
L0622R:ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG (SEQ ID N0.8)。
[0013]一種利用SSR引物組鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的方法，包括如下步驟:
(1)以待檢測辣椒幼苗基因組DNA為模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物對進行PCR擴增；
(2)對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測；如果產(chǎn)物中同時含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的條帶，或者同時含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的條帶，則該辣椒樣品為‘匯豐2號’真雜種。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的SSR標記、引物組以及方法可將‘匯豐2號’雜交種與其母本、父本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度。本方法具有快速、準確、低成本和操作簡單等優(yōu)點，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應用價值。
[0015]本發(fā)明引物組還可以用于辣椒品種‘粵紅1號’、‘匯豐1號’、和‘匯豐5號’種子真?zhèn)涡缘蔫b定。
【附圖說明】
[0016]圖1為L0143引物對鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的部分PCR產(chǎn)物電泳圖，其中PpP2*別為母本和父本泳道，其特征帶型分別長141bp和149bp ;編號1-20為‘匯豐2號’雜交種泳道，除編號17的單株為父本特征帶型外，其它都同時具有母本和父本特征條帶；
圖2為L0622引物對鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的部分PCR產(chǎn)物電泳圖，其中P1、P^別為母本和父本泳道，其特征帶型分別長196bp和208bp ;編號1-20為‘匯豐2號’雜交種泳道，除編號17的單株為父本特征帶型外，其它都同時具有母本和父本特征條帶；圖3為L0143和L0622的引物對同時擴增‘粵紅1號’、‘匯豐1號’、‘匯豐2號’和‘匯豐5號’4個辣椒品種的電泳圖，其中第1、2泳道分別為L0143和L0622的引物對擴增‘粵紅1號’的帶型；第3、4泳道分別為L0143和L0622的引物對擴增‘匯豐1號’的帶型；第5、6泳道分別為L0143和L0622的引物對擴增‘匯豐2號’的帶型；第7、8泳道分別為L0143和L0622的引物對擴增‘匯豐5號’的帶型，每個品種都有其特異的帶型組合，能與其它3個品種區(qū)分。
【具體實施方式】
[0017]一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的SSR分子標記L0143，其定位于辣椒第1號染色體上，包括母本L0143-1和父本L0143-2，其大小分別為141bp和149bp。
[0018]優(yōu)選的，所述SSR分子標記L0143，其母本L0143-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，父本L0143-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0019]用于PCR擴增上述SSR分子標記L0143的引物對。
[0020]優(yōu)選的，用于PCR擴增SSR分子標記L0143的引物對，其序列如下所示:
L0143F:ATGGAGCACCATACTCAAACAACC (SEQ ID N0.3)；
L0143R:GTTTACATCTCCCGACTGAAACTCCG (SEQ ID N0.4)。
[0021]一種用于鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的SSR分子標記L0622，其定位于辣椒第6號染色體上，包括母本L0622-1和父本L0622-2，其大小分別為196bp和208bp。
[0022]優(yōu)選的，所述SSR分子標記L0622，其母本L0622-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，父本L0622-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0023]用于PCR擴增上述SSR分子標記L0622的引物對。
[0024]優(yōu)選的，用于PCR擴增SSR分子標記L0622的引物對，其序列如下所示:
L0622F:GCTCATCAACCCACCTTCATCA (SEQ ID N0.7)；
L0622R:ATGCGTTGTCCGAGTAGGGAAG (SEQ ID N0.8)。
[0025]一種利用SSR引物組鑒定辣椒品種‘匯豐2號’種子純度的方法，包括如下步驟:
(1)以待檢測辣椒幼苗基因組DNA為模板，使用上述L0143和/或L0622的SSR引物對進行PCR擴增；
(2)對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測；如果產(chǎn)物中同時含有SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的條帶，或者同時含有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的條帶，則該辣椒樣品為‘匯豐2號’真雜種。
[0026]優(yōu)選的，步驟(1)中提取辣椒幼苗基因組DNA的方法為TPS法，步驟如下:
①將約200mg辣椒幼苗葉片放入2.0ml離心管中，每個管中插一根塑料研磨棒，用長柄鑷子夾住在液氮中速凍約30s后快速研磨成粉末，