一種用于檢測c-kit基因突變的引物、探針及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測C-KIT基因突變的引物、 探針及相關試劑盒。
【背景技術】
[0002]C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4qll_12,全長約80kb。C-KIT編碼的C-KIT 蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，它是分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內(nèi) 的酪氨酸激酶區(qū)、跨膜區(qū)和配體結合位點胞外區(qū)。當配體與其結合后能激活自身酪氨酸蛋 白激酶活性，通過一系列反應激活下游信號轉(zhuǎn)導通路，從而調(diào)節(jié)細胞的生長與增殖。
[0003]胃腸道間質(zhì)瘤（GIST)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。研究表明，在GIST患者 中C-KIT基因突變率約為90%。
[0004]目前Sanger測序法是C-KIT基因突變檢測的主要方法。然而，該方法的靈敏度低， 會導致漏檢及假陰性的發(fā)生，而且檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。臨床上迫切 需要開發(fā)一種高靈敏度、快速的C-KIT基因突變檢測技術。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST)的日常檢測中發(fā)現(xiàn)了與胃腸道間質(zhì)瘤有 關的位于C-KIT基因的新突變位點，即1723-1728位缺失突變。本發(fā)明的發(fā)明人針對該突 變開發(fā)了一種快速、高靈敏、操作簡便的檢測試劑盒及相關的檢測方法，可以用于GIST化 療預后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，所述突變是 1723-1728位缺失6堿基突變（1723_1728del6,Q575_L576del)。本發(fā)明的引物與探針 包括如下序列：
[0007]正向引物（F) :GITTACATAGACCCAACACCTTA(SEQIDNo:1)
[0008]反向引物（R) :CCCTGITTCATACTGACCAA(SEQIDNo:2)
[0009]探針（PB) :CTCAGCCTGTITCTGGGAAACTCCC(SEQIDNo:3)
[0010] 本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變的檢測試劑盒，所述試劑盒包 括SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 2所示的引物和SEQIDNo. 3所示的探針。
[0011] 根據(jù)所采用的PCR方法，本發(fā)明的試劑盒還可以包括內(nèi)參基因和內(nèi)控基因。
[0012] 本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變方法，其包括以下步驟：
[0013] (1)針對C-KIT的突變位點，設計特異性引物和探針；
[0014] (2)提取檢測樣本中基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全 血和血漿等；
[0015] (3)建立實時熒光PCR擴增反應體系；
[0016] (4)根據(jù)熒光PCR儀顯示的Ct值判斷檢測結果：檢測反應體系的FAM熒光強度， 以FAM達到設定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰性、陽性判定標準，Ct值> 38或 無擴增為陰性，ct值< 38為陽性。
[0017] 本發(fā)明采用了特異性引物和探針技術，可以特異性檢測C-KIT基因突變。此方法 靈敏度高、特異性強、檢測速度快。
【附圖說明】
[0018] 圖1為檢測陰性樣本的PCR圖。
[0019] 圖2為檢測突變陽性樣本的PCR圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例，對本發(fā)明進一步闡述。應理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照本領域技術人員熟 知的常規(guī)條件，或者按照制造廠商建議的條件。
[0021] 一 ?原理
[0022] 本發(fā)明的特異性引物與探針同DNA模板結合后，TaqDNA聚合酶以脫氧核苷酸 (dNTP)為底物，對內(nèi)參基因（InternalReference，IR)及C-KIT基因突變型基因進行體外 擴增。檢測采用熒光PCR技術，通過特異性探針水解釋放熒光，監(jiān)測PCR反應的進行，確定 C-KIT基因突變情況。
[0023] 本發(fā)明的試劑盒單獨設置了內(nèi)參基因檢測體系。內(nèi)參基因是區(qū)別于待檢C-KIT基 因的管家基因。通過檢測內(nèi)參基因的擴增情況（FAM通道），可分析待檢DNA是否能被正常 擴增，從而排除DNA純度、濃度不佳，或者含有PCR抑制劑等造成PCR檢測失敗的情況。
[0024] 本發(fā)明的試劑盒在C-KIT基因突變型檢測體系中同時設置了內(nèi)控基因（Internal Control，IC)檢測體系。兩種體系在同一PCR管中同時進行反應。內(nèi)控基因也是區(qū)別于待 檢基因C-KIT的管家基因。將識別C-KIT基因突變模板的探針修飾為FAM熒光基團，而將 識別內(nèi)控基因模板的探針修飾為ffiX熒光基團。通過檢測內(nèi)控基因擴增情況（HEX通道）， 可分析待檢DNA是否能被正常擴增，從而排除漏加試劑或樣本、樣本含有PCR抑制劑等造成 PCR檢測失敗的情況。
[0025] 進行本試劑盒檢測結果判定時，陰性質(zhì)控品（NC)中FAM、HEX通道檢測均應無擴增 (不呈典型的S型曲線。注：典型的S型曲線依次表現(xiàn)為指數(shù)期、直線期及平臺期）或無ct 值，陽性質(zhì)控品（PC)中FAM、HEX通道檢測均應有擴增（呈典型的S型曲線）且Ct值彡28; 否則認為實驗無效，需重復實驗。
[0026] 二.實驗材料和設備
[0027] 1.針對突變位點設計合成特異性引物和探針
[0028] 針對C-KIT基因突變位點設計特異引物和探針。通過特異性引物和探針優(yōu)化，以 便實現(xiàn)尚靈敏和快速檢測。
[0029] 優(yōu)化后的引物與探針如下：
[0030]正向引物（F) :GITTACATAGACCCAACACCTTA(SEQIDNo:1)
[0031]反向引物（R) :CCCTGITTCATACTGACCAA(SEQIDNo:2)
[0032]探針（PB) :FAM-CTCAGCCTGTITCTGGGAAACTCCC-BHQ-1(SEQIDNo:3,含熒光標記）
[0033] 2.檢測樣本處理與DNA的提取
[0034] 檢測樣本可以是新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全血、血漿和腹腔積液。以下僅以 石蠟包埋組織樣本為例進行說明。
[0035] 在樣本采集之前，病人未經(jīng)過酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinaseinhibitors， TKIs)類藥物治療；由于DNA樣品質(zhì)量會影響檢測結果，因此應確定DNA樣品來源的石蠟包 埋組織樣本中含有癌組織細胞，并且不少于整個樣本的25% ;且DNA樣品0D260/0D280 = 1. 8±0. 2, 0D260/0D230 彡 1. 7 ;濃度為 5-10ng/y1。
[0036] 石蠟包埋組織樣本在室溫下保存時限不超過12個月，提取后的DNA樣品在_20°C 冷凍條件下保存時限不超過6個月。
[0037] 3.適用儀器
[0038] Stratagene Mx3000P〇
[0039] 4.試劑盒的組成
[0040] 試劑盒組成見表1。試劑盒中不含核酸提取成份，使用QIAampDNAFFPETissue Kit(Qiagen公司生產(chǎn)，貨號：56404)試劑盒完成石蠟包埋組織樣本DNA提取。檢測試劑組成 及C-KIT基因待檢突變位點見表2。IR檢測試劑只含內(nèi)參基因檢測體系（FAM通道），C-KIT 檢測試劑同時含有C-KIT基因突變檢測體系（FAM通道）及內(nèi)控基因檢測體系（HEX通道）。
[0041] 表1 :試劑盒組成
[0042]
[0043] 其中所述內(nèi)參基因和內(nèi)控基因的具體序列可以由本領域技術人員根據(jù)實驗情況 容易地確定。
[0044] 三.檢測方法
[0045] 1?使用QIAampDNAFFPETissueKit(Qiagen公司生產(chǎn)）試劑盒，按照使用說明 書進行石蠟包埋組織樣本DNA提取。
[0046] 2.取試劑盒中的檢測試劑以及陽性質(zhì)控品（PC)。待檢測試劑及陽性質(zhì)控品PC融 化后短暫離心，置于冰上。
[0047] 3.按17 : 0.3的體積比例混合IR檢測試劑和TaqDNA聚合酶，按17 : 0.3的體 積比例混合C-KIT檢測試劑和TaqDNA聚合酶。按17. 3/孔分裝IR檢測試劑和C-KIT檢 測試劑至八連管中。向裝有IR檢測試劑和C-KIT檢測試劑的八連管中分別加入2. 7y1待 檢DNA樣品、陰性質(zhì)控品（NC，溶解DNA的緩沖液，由使用者自備）及陽性質(zhì)控品PC，吹打混 勻，蓋緊管蓋后短暫離心。注意：混勻時不要使用漩渦振蕩儀；混勻后立即進行后續(xù)操作。
[0048] 4.熒光PCR儀檢測通道設定需同時選擇FAM、HEX通道（參比染料設置為"無"）。 反應程序設置如下（表2):
[0049]表 2 :
[0050]
[0051] 四.檢測結果的解釋
[0052] 1.Ct值確定：首先設定StratageneMX3000P熒光PCR儀的基線：選擇"適合基線 (Adaptivebaseline)"設定時的焚光信號，閾值（threshold)設定原則以閾值線剛好超過 正常陰性質(zhì)控品NC擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，即令陰性質(zhì)控品NC擴增曲線 顯示"NoCt"為準。從軟件中讀取各樣本在各位點檢測的Ct值。
[0053] 2.定性分析：
[0054] (1)實驗質(zhì)量評判：若NC中FAM、HEX通道檢測均無擴增（不呈典型的S型曲線。 注：典型的S型曲線依次表現(xiàn)為指數(shù)期、直線期及平臺期）或無Ct值，PC中FAM、HEX通道 檢測均有擴增（呈典型的S型曲線）且Ct值< 28,則可繼續(xù)分析；否則認為實驗無效，需 重復實驗。
[0055] (2)待檢DNA樣品中內(nèi)參基因（IR)檢測情況評判：若內(nèi)參基因檢測（FAM通道） 有擴增且19 <Ct值< 25,則可繼續(xù)分析；若其Ct值較小，則認為DNA樣品濃度過高；若其 Ct值較大或無擴增，則認為DNA樣品濃度過低、發(fā)生降解，或其中可能含有PCR抑制劑。
[0056] (3)待檢DNA樣品中內(nèi)控基因檢測情況評判：若內(nèi)控基因檢測（HEX通道）有擴增 且Ct值< 25,則可繼續(xù)分析；若內(nèi)控基因檢測（HEX通道）Ct值較大或無擴增，但突變位點 檢測（FAM通道）有擴增且Ct值< 38,則可繼續(xù)分析（可能由于突變位點擴增對內(nèi)控基因 擴增產(chǎn)生抑制）；若內(nèi)控基因檢測（HEX通道）Ct值較大或無擴增，而突變位點檢測（FAM通 道）無擴增或有擴增但Ct值> 38,則無法繼續(xù)分析，需重復實驗（可能由于DNA樣品發(fā)生 降解、其中含有PCR抑制劑或未加樣品）。
[0057] (4)待檢DNA樣品中基因突變情況評判：若樣品中某突變位點檢測（FAM通道）有 擴增且Ct值< 38,則判定該樣本突變結果為陽性；若Ct值> 38或無擴增，則判定該樣本 突變結果為陰性。
[0058] 注意：同一DNA樣品中可能同時存在多種突變。
[0059] 圖1為檢測結果為陰性的樣本的PCR圖，圖2為檢測結果為陽性的樣本的PCR圖。
[0060] 通過對比檢測，證實本發(fā)明的熒光PCR方法和傳統(tǒng)測序方法的結果是相符的，而 本發(fā)明的熒光PCR方法的靈敏度和選擇性高于傳統(tǒng)測序方法。
[0061] 因此，本發(fā)明熒光PCR反應體系可檢測C-KIT基因1723-1728位缺失6堿基突變， 檢測方便快捷，準確性高，可滿足C-KIT基因突變快速檢測的要求。
【主權項】
1. 一種用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，其特征在于，所述引物如SEQ ID No. I-SEQ ID No. 2所示，所述探針如SEQ ID No. 3所示。2. -種用于檢測C-KIT基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括SEQ ID No. I-SEQ ID No. 2所示的引物和SEQ ID No. 3所示的探針。3. 如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，其還包括內(nèi)參基因和內(nèi)控基因。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測C-KIT基因突變的引物、探針及試劑盒。所述引物如SEQ？ID？No.1-SEQ？ID？No.2所示，所述探針如SEQ？ID？No.3所示。利用本發(fā)明的試劑盒進行實時熒光PCR，可以檢測C-KIT基因1723-1728位缺失突變。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105112500
【申請?zhí)枴緾N201510364301
【發(fā)明人】莫敏俐, 李暉, 陳釗, 丁鳳
【申請人】北京雅康博生物科技有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年6月29日