表面和第二表面，所述基片第一表面間隔設(shè)置有多個流道形成的反應(yīng)池陣列，每個所述流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁沿所述流道的長度方向延伸并在所述流道的兩端交匯形成兩個帶有夾角的錐形末端，所述兩個錐形末端表面分別設(shè)置有與所述基片第二表面連通的流體輸入孔和流體輸出孔，所述基底層包括透明基底和設(shè)置在所述透明基底表面的間隔層，所述間隔層與所述基片第一表面接觸且所述間隔層對應(yīng)所述流道所在的位置設(shè)置有腐蝕凹槽。
[0037]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述透明基底包括表面帶有官能團為環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基中的一種的透明的玻璃、石英或有機聚合物材料。
[0038]優(yōu)選地，步驟(I)中，所述基板包括硅片、玻璃、金屬或陶瓷中的一種。
[0039]優(yōu)選地，步驟(2)中，所述模型膠包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙烯-醋酸乙烯(EVA)和聚胺脂(PUA)中的一種或多種，但不限于此，只要是適用于軟光刻法的模型膠即可。
[0040]更優(yōu)選地，步驟(2)中，所述模型膠為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0041]如本發(fā)明所述的，所述基片的材質(zhì)與模型膠相同。
[0042]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述聚甲基戊二酰亞胺(PMGI)層的厚度為1_5 μπι。
[0043]本發(fā)明中，所述聚甲基戊二酰亞胺，其英文全稱為polymethylglutarimide (PMGI)，所述PMGI 是購買自 MicroChem公司的、產(chǎn)品名為 SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7、SF7.5、SF8、SF9、SF10、SFlU SF12、SF13、SF14、SF15、SF17、SF19、SF23中的一種或多種。
[0044]優(yōu)選地，所述PMGI是購買自MicroChem公司的、產(chǎn)品名為SFll的聚甲基戊二酰亞胺。
[0045]優(yōu)選地，步驟(4)中，每個流道內(nèi)N-甲基吡咯烷酮的注入量為100-500 μ L0
[0046]所述N-甲基吡咯烷酮的注入量可以將與各流道接觸的透明基底上的聚甲基戊二酰亞胺腐蝕掉，并在間隔層對應(yīng)流道所在的位置得到腐蝕凹槽，以使透明基底上表面帶有的官能團(環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基等)暴露出來。所述間隔層用于阻隔各流道內(nèi)的樣本之間的接觸，保證每個流道內(nèi)樣本的單獨控制。
[0047]如本發(fā)明所述的，在將基片與表面修飾的透明基底進行氧等離子處理表面之前，制備PMGI層的目的是為了保護透明基底表面的官能團(如環(huán)氧基、氨基、羧基、巰基和醛基中的一種)，避免其受等離子氧處理的影響，使得后續(xù)的基因樣本固定到透明基底上。修飾后的透明基底在經(jīng)過氧等離子清洗后，透明基底的表面由疏水性變成親水性；再向每個流道注入N-甲基吡咯烷酮，該試劑可以將與各流道接觸的PMGI腐蝕掉，使得透明基底表面的官能團再次暴露。
[0048]該單分子測序芯片的流道為親水性，可以減少對待測基因樣本(如DNA)的非特異性吸附，同時使基底表面的官能團不受影響。
[0049]優(yōu)選地，步驟(4)中，所述基片與透明基底的壓合具體為:先將基片與透明基底初步貼合，并放入溫度為95_120°C的烤箱內(nèi)，用重物壓住烘烤l_3h。
[0050]優(yōu)選地，步驟(I)中，所述光刻法包括以下步驟:
[0051]a、將負性光刻膠通過旋涂法制備到基板表面，得到勻膠后的基板，其中基板表面的光刻膠層厚度為600-650 μπι ;
[0052]b、對勻膠后的基板進行前烘處理，所述前烘的溫度控制為:緩慢加熱到90-100°C并穩(wěn)定15-20min，之后自然冷卻至室溫；
[0053]C、將設(shè)計好的反應(yīng)池陣列的圖形模板作為掩膜版，并覆蓋在前烘處理后的基板表面，進行曝光處理，曝光時間為90-150s ；
[0054]d、將曝光后的基板進行后烘處理，所述后烘的溫度控制為:先緩慢加熱到90_95°C并穩(wěn)定5-10min，之后自然冷卻至室溫；
[0055]e、將后烘處理后的基板浸入顯影液中，進行顯影處理，清洗掉掩膜版以外的部分，得到反應(yīng)池陣列的陽膜；
[0056]優(yōu)選地，在進行所述光刻法的步驟a之前，還包括對基板進行以下預(yù)處理:
[0057]依次用無水乙醇、水清洗基板表面，之后將清潔過的基板置于150°C的熱板上加熱1min,使表面水分徹底蒸發(fā)。
[0058]優(yōu)選地，在所述光刻法的步驟e之后，還包括以下處理:
[0059]f、將步驟e得到的反應(yīng)池陣列的陽膜進行硬烘處理，所述硬烘是在所述陽膜上加一玻璃板，并壓一鐵塊，加熱至130-150°C下烘烤45-60min。
[0060]所述硬烘是為了使陽膜的光刻膠層更牢固地粘附在基板表面，并增加光刻膠層的抗刻蝕能力。
[0061]優(yōu)選地，步驟b中，所述前烘的溫度控制為:先在65°C時烘烤6min，再按1°C /min的速率逐漸升溫至95°C，保持20min，自然冷卻至室溫。所述前烘的目的是將光刻膠中的有機溶劑蒸發(fā)掉，并使光刻膠凝固。
[0062]優(yōu)選地，步驟e中，所述后烘的溫度控制為:先以0.50C /min的速率逐漸升溫至95°C，保持5min，再以1_3°C /min的速率自然冷卻至室溫。所述后烘的目的是以使曝光部分的負性光刻膠的交聯(lián)反應(yīng)充分進行。
[0063]優(yōu)選地，所述負性光刻膠為SU-82150。
[0064]本發(fā)明有益效果包括以下幾個方面:
[0065]1、所述單分子測序芯片具有一定數(shù)目的流道，將各流道設(shè)計為較窄的流道，并且在流體進出口均設(shè)計成錐形，有利于形成流體緩沖帶，可使流道內(nèi)流體的沖刷切換徹底，不存在流體回流區(qū)，利于生化反應(yīng)進行；同時流道的深度又較深，使流道內(nèi)流體的流動阻力越小，可提高所述單分子測序芯片的相應(yīng)時間。
[0066]2、所述單分子測序芯片中集成化的多流道的設(shè)計增加了基底的支撐面，非常有利于減小由于負壓吸液造成的基底形變，克服了由于基底變形造成的芯片系統(tǒng)中流體的進樣異常問題以及采集的圖像效果不佳的問題。
[0067]3、所述單分子測序芯片，采用多條并行的流道設(shè)計，各流道之間相互獨立，可以實現(xiàn)每個流道內(nèi)樣本的單獨控制，保證了樣本間無交叉污染，同時該單分子測序芯片無需像二代測序芯片中，在每個樣本進樣之前都要加入特定的一段序列“barcode”以識別出每個樣本，簡化基因樣品準備的流程和后續(xù)的生物信息分析流程。
[0068]4、由于模型膠(如PDMS等)本身超強的疏水性，其容易非特異性地粘附DNA等生物大分子，使得其較少被報道應(yīng)用于DNA測序芯片的基片。本發(fā)明基于軟光刻-澆筑工藝制作出適合單分子DNA測序的芯片，在保護基底表面的官能團的前提下，采用等離子處理將基片表面由疏水性改成親水性，使其能符合DNA測序芯片的要求，該單分子測序芯片的流道既可以減少對待測DNA分子的非特異性吸附，同時基底表面是官能團不受影響。
[0069]5、由于光刻法制成的反應(yīng)池陣列的陽膜可以重復(fù)多次澆筑使用，有利于單分子測序芯片的批量生產(chǎn)，并會進一步降低制造成本。
【附圖說明】
[0070]圖1為本發(fā)明實施例1中單分子測序芯片的剖面結(jié)構(gòu)示意圖，I為基片，21為透明基底，22為透明基底21上的間隔層，2為21與22構(gòu)成的基底層，Ib為基片I的第二表面，11為流道，12為基片的第二表面Ib連通的流體輸入孔，間隔層22對應(yīng)流道所在位置設(shè)置的腐蝕凹槽的深度用h表示；
[0071]圖2是本發(fā)明實施例1中單分子測序芯片的基片的俯視結(jié)構(gòu)示意圖，I為基片，11為流道，12、13分別為流體輸入孔和流體輸出孔，111、112分別為流道相對設(shè)置的兩個側(cè)壁，113為流道的錐形末端，d表示的距離為每個流道的寬度，I表示的距離為每個流道的長度；
[0072]圖3為本發(fā)明實施例的單分子測序芯片的制備方法的示意圖，其中3為制作反應(yīng)池陣列的陽膜的基底，Ia為基片I的第一表面，Ib為基片I的第二表面；
[0073]圖4為二代測序芯片與本發(fā)明實施例1中單分子測序芯片的流體力學(xué)仿真模擬結(jié)果的對比；
[0074]圖5為二代測序芯片與本發(fā)明實施例3中單分子測序芯片的透明基底的變形情況對比。