-1507F(如圖1A所示）、下游引物H7-1593R(如圖1B所示）和 探針H7-1540P(如圖1C所示）和現(xiàn)有的H7N9的HA序列完全匹配，結(jié)果表明，本方法中合 成的引物和探針序列針對于所述的突發(fā)的H7N9病毒的序列是完全保守的；
[0040] 似方法的靈敏度
[0041]采用克隆質(zhì)粒標準品（109~103copies/ml)，進行qRT-PCR，獲得擴增曲線和標準 曲線（如圖2A，2B所示），標準曲線的斜率為-3. 71，其線性相關(guān)系數(shù)r2為0. 998 ;確定本方 法的檢測最低限為0. 5p化/ml的病毒，通過標準曲線，確定建立的qRT-PCR方法最低能檢測 到每個反應5個基因拷貝的病毒核酸；
[004引做方法的特異性
[0043] 使用BLAST(primerBLAST)工具在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行了比對分析，未發(fā)現(xiàn)上 下游引物或探針和數(shù)據(jù)庫中其他物種有PCR擴增的模板匹配可能性；使用該PCR方法對17 株常見的呼吸道感染病毒株進行檢測，檢測結(jié)果均為陰性（如2C所示）。
[0044] (4)方法學比較和臨床樣本檢測結(jié)果
[0045] 采用國家CDC提供的H7N9病毒real-timeRT-PCR方法進行驗證，結(jié)果顯示，本發(fā) 明的qRT-PCR方法的陽性符合率為96. 6% (28/29)，陰性符合率為76. 5% (39/51)，總體符 合率為83. 8%化7/80)(如表2所示）；對13份不吻合結(jié)果采用WHO的方法進行檢測，結(jié)果 顯示本方法與WHO的方法陽性符合率達到92. 3% (12/13)(如表3所示）。
[0046] 表2qRT-PCR和參比方法（國家CDC的rRT-PCR)的檢測結(jié)果統(tǒng)計
[0047]
[004引表3不符合標本采用W冊的檢測Influenza A的rRT-PCR檢測結(jié)果統(tǒng)計
[0049]
[0050] 本發(fā)明的方法，通過和Genbank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有人感染H7N9病毒進行序列比對分 析，顯示本方法合成設計的引物和探針對于所述的流行的H7N9病毒是完全保守的；通過靈 敏度和特異性實驗結(jié)果顯示，本方法具有較高的檢測靈敏度（每個反應5個基因拷貝），并 且該方法對17種常見呼吸道感染病毒（包括sHlNl，S冊肥，2009pandemi地1N1目前常見的 感染人的A型流感病毒亞型）沒有交叉反應，可W特異地檢測H7N9 ;本方法與國家CDC提供 的檢測方法在80份臨床標本進行對比檢測，并采用WHO推薦檢測流感病毒A型的rRT-PCR 對13份不吻合標本進行復核，檢測結(jié)果均為陽性，表明本方法的檢測結(jié)果是準確可靠的。
[0051] 本發(fā)明方法相對于國內(nèi)外用于檢測H7N9的方法，可W對臨床樣本中H7N9病毒拷 貝數(shù)進行定量分析，并具有較好的特異性、靈敏度和準確性，適用于臨床樣本的大規(guī)模檢 巧1|。本發(fā)明中，采用本方法在上海地區(qū)14例接受達菲治療病人中進行治療前后的H7N9病 毒載量監(jiān)測，檢測結(jié)果準確地提示了達菲耐藥的產(chǎn)生，為臨床治療策略的優(yōu)化提供了重要 依據(jù)。
【附圖說明】
[0052]圖1顯示了Bioedit分析引物和探針序列的保守性，其中，
[005引（A)上游引物H7-1507F和16株2013年來自中國福建，杭州，南京，南昌，無錫W及 臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)的H7N9的H7序列的比對結(jié)果；
[0054] 度）下游引物H7-1593R和16株2013年來自中國福建，杭州，南京，南昌，無錫W及 臺灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)的H7N9的H7序列的比對結(jié)果；
[005引 似探針H7-1540P和16株2013年來自中國福建，杭州，南京，南昌，無錫W及臺灣 地區(qū)發(fā)現(xiàn)的H7N9的H7序列的比對結(jié)果。
[0056] 圖2顯示了Realtime RT-PCR方法的靈敏度和特異性實驗結(jié)果，其中，
[0057] (A)使用克隆質(zhì)粒標準品（109~103copies/mU進行PCR擴增獲得的英光曲線；
[005引做使用克隆質(zhì)粒標準品（109~103copies/ml)進行PCR擴增獲得的標準曲線 (其中X代表樣品中DNA的拷貝數(shù)的loglO值，Y代表擴增的Ct值）；
[0059] 似使用17種呼吸道感染常見病毒株進行PCR擴增的英光曲線（陽性質(zhì)控品是 107copies/ml克隆標準品）。
【具體實施方式】
[0060] 實施例1
[0061] 1材料和方法
[0062] 2. 1臨床標本的采集
[0063] 2013年4至6月期間，從上海市公共衛(wèi)生臨床中必收集了 18例H7N9感染患者共 684份臨床標本，其中咽拭子253份，姨液30份，尿液228份，糞便173份。
[0064] 2. 2引物設計
[0065] 根據(jù)Genbank中收錄的人感染H7N9的HA全長序列，使用PrimerExpress3. 0設計 合成了檢測H7N9病毒核酸的特異性英光定量PCR引物和探針。使用NCBI網(wǎng)站上的BLAST 工具和BioEdit軟件（version?. 0.9)分析新設計引物和探針的保守性。引物和探針由上 海Invitrogen公司合成。
[0066] 2. 3病毒培養(yǎng)，核酸提取，qRT-PCR
[0067] 選取10份來自不同患者的咽拭子樣本，接種在犬腎上皮細胞（MDCK細胞）培養(yǎng)兩 代W上。MDCK細胞培養(yǎng)采用含10%的小牛血清和5%的青鏈霉素和兩性霉素B溶液的MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。接種病毒后采用含2 %的小牛血清和5 %的青鏈霉素和兩性霉素B溶液 的MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。H7N9陽性培養(yǎng)物通過空斑形成試驗進行滴定病毒濃度（P化/ml)。
[0068]用QIAampViralRNAMiniKit(250) (Qiagen52906)提取病毒基因組RNA。將 140y1 樣本加入 560y1 含polyA(l〇yg/ml)的AVL中，15 ~25°C放置lOmin;加入 560y1 無水己醇，顛倒混勻后簡短離必；用柱子吸附RNA，加入AW1溶液500y1，800化pm離必1分 鐘；再加入AW2溶液500y1，8000巧m離必1分鐘；13000巧m離必2分鐘；最后用60y1AVE 洗脫RNA。
[0069]qRT-PCR采用試劑盒燈akaraRR064A)進行，25y1反應液中包含2XBufferMix III12. 5y1,TaKaRaExTaq服巧U/y1) 0. 5y1,PrimeScriptRTEnzymeMixII0. 5y1,上游 引物H7F8pmol,下游引物H7R8pmol，探針H7Pb4pmol，RNA模板 2. 5y1，DEPC水補足 25y1。 PCR反應條件；42°C反轉(zhuǎn)錄，lOmin;95°C預變性30s;95°C10s，6(TC45s，運行45個循環(huán)，在 6(TC進行英光采集。反應在實時英光定量PCR儀（AppliedBiosystems，ViiA?7系統(tǒng)）上 進行，引物和探針序列如表1所示。
[0070] 2. 4T-A克隆
[007URT-PCR采用試劑盒燈akaraRR064A)進行，50y1反應液中包含2XBufferMix III25y1，TaKaRaExTaq服巧U/y1) 1y1，PrimeScriptRT化zymeMixII1y1，上游引物HA-1144(5, -GGAATGATAGATGGNTGGTAYGG-3,）10pmol，下游引物
[0072]HA-Reverse(5, -ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3,）lOpmol,RNA模板 5y1，DEPC水補足 50y1。PCR反應條件；42°C反轉(zhuǎn)錄，20min;95°C預變性 30s;95°C15s， 50°C30s, 72°C40s運行 40 個循環(huán)，72°C延伸 5 分鐘。反應在ElppendorfMaster巧clerep gradientPCR儀上進行。
[007引取一份RT-PCR陽性產(chǎn)物50y1進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。采用割膠純化試劑 盒（Invitrogen,K2100-12)回收664bp大小的PCR產(chǎn)物。通過T-A克隆試劑盒（Takara, D101A)將PCR產(chǎn)物克隆進PMD18-T載體。通過M13引物測序獲得克隆片段序列，然后使用 BLAST工具對克隆片段進行比對，確認插入目的片段的正確性。
[0074] 2. 5建立qRT-PCR定量分析的標準曲線
[0075]采用T-A克隆質(zhì)粒制作標準品，建立H7N9病毒核酸定量標準曲線。首先微量紫外 分光光度計燈hermo，Nano化opND-2000C)對克隆質(zhì)粒進行核酸定量，然后進行10倍模板稀 釋，制作1〇9~10 3copies/ml的標準品，糾示準品為模板進行qRT-PCR，獲得標準曲線。2. 6 方法的靈敏度測試
[0076] 選取一株已滴定的H7N9培養(yǎng)物，用病毒培養(yǎng)液進行10倍稀釋至10-3p化/ml病 毒滴度。提取所有稀釋培養(yǎng)物的病毒基因組RNA。每份樣本采用新建立的qRT-PCR進行重 復20次檢測。按病毒滴度從低到高排列統(tǒng)計檢測結(jié)果，將第一個出現(xiàn)不低于90%陽性率 (> 18次陽性擴增）的病毒滴度作為可能的最低檢測滴度A。然后再將該稀釋培養(yǎng)物，用 病毒培養(yǎng)液2倍依次稀釋3次，分別獲得病毒滴度為A/2,A/4,A/8的稀釋物。提取H個稀 釋度的RNA后采用新建立的qRT-PCR進行重復20次檢測，確定該qRT-PCR方法的最低檢測 病毒滴度，即將兩次稀釋的病毒培養(yǎng)液按照滴度從低到高排列統(tǒng)計檢測結(jié)果，第一個出現(xiàn) 不低于90%陽性率的病毒滴度為該PCR的最低