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      高產(chǎn)洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillusclavatus)Ac-32菌株及其應用

      文檔序號:9466743閱讀:643來源:國知局
      高產(chǎn)洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其應用
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)微生物領(lǐng)域,尤其涉及I株液體發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin的棒曲霉XAspergillus clavatus) Ac-32菌株、用途和發(fā)酵生產(chǎn)方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002]近年來,我國人群的心血管病患病率、發(fā)病率及其危險因素水平不斷上升,最新全國疾病監(jiān)測系統(tǒng)的數(shù)據(jù)顯示,我國心血管病占總死亡的比例從37.5%上升至40.7%。曲霉的次級代謝產(chǎn)物洛伐他汀(Lovastatin),因在高血脂、動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的防治中作用機理明確、臨床療效顯著,已成為治療心血管疾病的最暢銷藥品之一。
      [0003]1979年,日本學者遠滕章(Akira Endo)等從紅色紅曲霉(iftwasciA? ri/Aer)發(fā)酵液中分離得到一種可抑制體內(nèi)膽固醇合成的活性物質(zhì),命名為莫納可林K (Monacolin K)。1980年,Alberts等從土曲霉terreus)中提取到相同的化合物,現(xiàn)命名為Lovastatin (洛伐他汀)。1982年,Paulus等研究了 Lovastatin及其類似物在家兔體內(nèi)的降膽固醇活性。1987年,美國Merck公司經(jīng)FDA批準,率先推出人類歷史上第一個羥甲基戊二酞輔酶A還原酶抑制劑Lovastatin,被認為是降血脂藥物研究進展的一個里程碑。自此,微生物發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin的研究取得了長足的進步。
      [0004]國內(nèi)從20世紀90年代初期開始對Lovastatin類物質(zhì)進行研究,但Lovastatin類藥物是一類重要的聚酮類化合物,因具有復雜的結(jié)構(gòu)而難以通過合成的方法來進行大規(guī)模生產(chǎn),而美國和日本等國家己通過發(fā)酵的方式開發(fā)出一系列的Lovastatin藥物,但我國對降脂曲霉的研究生產(chǎn)中普遍存在產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)成本偏高等問題。究其原因主要是缺乏優(yōu)良的生產(chǎn)菌株和發(fā)酵工藝。因此,選育出穩(wěn)定高產(chǎn)Lovastatin的菌種顯得非常的迫切,也是Lovastatin工業(yè)化生產(chǎn)的基本保障。
      [0005]曲霉屬真菌廣泛分布于食品、土壤、空氣和各種有機質(zhì)中,主要以枯死的植物、動物的排瀉物及動物尸體為營養(yǎng)源。不同種類的曲霉生活習性差異較大,大多數(shù)曲霉屬于中溫性,少數(shù)為高溫性。多數(shù)為好氧性,對水分的要求為中生性,孢子萌發(fā)的最低相對濕度一般在85%以下,其中一些干生性曲霉在相對濕度為65%左右時萌發(fā)。曲霉屬真菌能夠產(chǎn)生葡萄糖氧化酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等多種具有催化作用的酶;檸檬酸、葡萄糖酸等在工業(yè)和制藥上起著重要作用的有機酸;此外還會產(chǎn)生具有重要應用價值的生理活性物質(zhì)Lovastatin。
      [0006]曲霉在食品藥品生產(chǎn)中獲得了長期的實踐證明,曲霉多數(shù)種都是較安全的,在市售的藥品中,Lovastatin于20世紀90年代直接開發(fā)為治療高血壓的藥物,其生產(chǎn)和應用均不存在安全隱患,能直接應用于食品藥品。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007]針對市場上Lovastatin需求日益增長,生產(chǎn)Lovastatin優(yōu)良工業(yè)菌株的缺乏等的問題。本發(fā)明的目的是提供I株高產(chǎn)Lovastatin棒曲霉clavatus)kc~?,2菌株和發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin的方法。
      [0008]本發(fā)明所述棒曲霉cJaKaii/6.) Ac_32菌株,保藏編號為:CCTCC M2015504,保藏地為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址為:中國,武漢,武漢大學,保藏日期為:2015年9月I日。該棒曲霉(clavatus) Ac_32菌株可用于發(fā)酵生產(chǎn)Lovastatin0
      [0009]本發(fā)明所涉及的Ac-32曲霉菌株篩選自自然發(fā)酵的面包,經(jīng)初篩、復篩和培養(yǎng)條件優(yōu)化后獲得,5 L發(fā)酵罐發(fā)酵110 h -140 h,其Lovastatin產(chǎn)量可達200 mg/L~ 250 mg/L左右。經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和18S rDNA基因序列分析,鑒定為棒曲霉(
      cla va tus )。
      [0010]該棒曲霉Ac-32菌株用于生產(chǎn)洛伐他汀的方法,該方法包括以下的步驟:
      1)用接種針挑少量棒曲霉Ac-32菌株菌絲,轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平皿中,活化培養(yǎng)2~4d ;取平皿中I菌餅接種于H)培養(yǎng)液中,搖床培養(yǎng)2~4 d,制得一級種子;
      2)在種子培養(yǎng)液中,按種子培養(yǎng)液質(zhì)量的3~8%加入一級種子,100-300r/min搖床培養(yǎng)l~3d成二級種子;
      3)在發(fā)酵罐中按發(fā)酵物質(zhì)量的10~20%接入二級種子進行發(fā)酵培養(yǎng)。
      [0011]作為優(yōu)選,所述的發(fā)酵培養(yǎng)的溫度范圍為25°C -35°C, pH范圍為3.5-6.5。
      [0012]作為優(yōu)選,所述的發(fā)酵物的有機碳源選用可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、麥芽糖、番薯粉和甘油中的一種或多種混合。
      [0013]作為優(yōu)選,所述的發(fā)酵物的氮源選用無機氮源和有機氮源中的一種或多種混合。作為再優(yōu)選,無機氮源選用硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨和硝酸銨中的一種或多種混合;有機氮源選用牛肉膏、干酪素、酵母粉、蛋白胨和尿素中的一種或多種混合。
      [0014]本發(fā)明所篩選的棒曲霉{Aspergillus cla va tus) Ac_32菌株,具有高產(chǎn)Lovastatin,生長速度快、產(chǎn)孢量大、培養(yǎng)簡單等優(yōu)良特性。在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.2,培養(yǎng)溫度為28°C條件下,Ac-32菌株通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后,5 L發(fā)酵罐發(fā)酵110 h -140 h,Lovastatin 產(chǎn)量可達 200 mg/L~ 250 mg/L 左右。
      【附圖說明】
      [0015]圖1 Ac-32曲霉菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d菌落正面(左)和背面(右)。
      [0016]圖2 Ac-32曲霉菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d分生孢子頭生長的顯微特征(100 X)。
      [0017]圖3 Ac-32曲霉菌株分生孢子頭顯微特征(呈棒狀,左200 X,左400 X)。
      [0018]圖4 Ac-32曲霉菌株分生孢子顯微特征(400 X)。
      [0019]圖5 Ac-32 曲霉菌株 18S rDNA 基因序列(1329 bp)。
      [0020]圖6基于18S rDNA基因序列建立的曲霉屬(Aspergillus)系統(tǒng)發(fā)育樹。
      [0021]圖7 Ac-32菌株在5 L發(fā)酵罐中菌絲生長曲線。
      [0022]圖8 Ac-32菌株在5 L發(fā)酵罐中Lovastatin產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的變化曲線。
      【具體實施方式】
      [0023]下面對本發(fā)明【具體實施方式】做一個詳細的說明。
      [0024]實施例1棒曲霉(cJaKaii/6.) Ac-32菌株的分離、篩選和鑒定 I培養(yǎng)基
      ①PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂粉2.0%,水I L,pH 5.5-6.0。用于曲霉菌株的分離純化和鑒定。
      [0025]②H)培養(yǎng)基:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水I L,pH 5.5-6.0。用于高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選。
      [0026]2實驗方法
      2.1曲霉菌株的分離純化
      從不同生境收集的自然發(fā)酵樣品(食品、土壤、有機質(zhì)等)表面挑取少量菌絲接入PDA培養(yǎng)基平板表面,28°C培養(yǎng)24 h,待白色絨毛狀菌絲長出后,取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一 PDA培養(yǎng)基平板上繼續(xù)培養(yǎng)3 d產(chǎn)生孢子后,顯微鏡觀察具有曲霉的典型特征,挑取少許邊緣菌絲純化3次,得性狀均一的曲霉純菌株。將分離純化獲得的曲霉菌株編號保存于25%甘油中,置于4 °C冰箱備用。
      [0027]2.2高產(chǎn)Lovastatin曲霉菌株的篩選
      用高效液相色譜法(HPLC)檢測曲霉菌株發(fā)酵液中Lovastatin產(chǎn)量進行篩選。曲霉各保存菌株28°C PDA平板培養(yǎng)3 d后,用打孔器取I菌餅(直徑0.8 mm)轉(zhuǎn)接種于H)培養(yǎng)液中,28°C、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d。取發(fā)酵液I mL,加甲醇4mL (按1:4的比例),超聲處理20 min,50°C水浴2 h, 3000 r/min離心3 min,取上清液,經(jīng)0.45 μ m濾膜過濾,利用HPLC法檢測Lovastatin產(chǎn)量,篩選高產(chǎn)Lovastatin的曲霉菌株。
      [0028]2.3 Ac-32曲霉菌株的鑒定
      用鑷子挑取少量該菌株菌絲,轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板中,活化培養(yǎng)3 d ;取平皿中I菌餅(直徑0.8 mm)接種于新的PDA培養(yǎng)基平板上,28°C,培養(yǎng)3 d,顯微鏡觀察Ac_32菌株的
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