一種大規(guī)模獲得高純度、高活性慢病毒的工藝方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于臨床基因治療，尤其設(shè)及一種大規(guī)模獲得高純度、高活性慢病毒的工 藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢病毒是由人類免疫缺陷病毒（HIV)，通過去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基 因改造而來。復(fù)制缺陷型HIV載體通常用水泡口炎病毒（vesicularstomatitisvi;rus)G 糖蛋白（VSV-G)來代替HIV-I的包膜進(jìn)行包裝，從而更安全，宿主范圍更廣，還能增加病毒 的滴度。目前，基因治療已經(jīng)被廣泛用于治療囊性纖維化、血友病、肌營養(yǎng)不良癥和鑲狀細(xì) 胞貧血等基因遺傳性疾病、血液病，W及腫瘤疾病當(dāng)中。
[0003] 在基因治療的環(huán)節(jié)中，早期應(yīng)用的是腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但腺病毒不 能整合至宿主細(xì)胞，且免疫原性高，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂細(xì)胞。慢病毒載體不僅能感染 分裂細(xì)胞，也能感染靜止期細(xì)胞，并且能穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)長期表達(dá)。在造血干細(xì) 胞移植治療應(yīng)用方面，慢病毒由于能感染大部分處于靜止期的造血干細(xì)胞，已經(jīng)成為一種 有效的感染HSCs和進(jìn)行基因治療的工具，因此慢病毒載體將能廣泛地應(yīng)用于基因治療領(lǐng) 域。
[0004] 用于基因治療的病毒載體在純度及滴度方面有極高的要求，通常在慢病毒載體的 生產(chǎn)制備過程中，收集的慢病毒原液含有培養(yǎng)基殘留、包裝質(zhì)粒殘留、包裝細(xì)胞殘留等成 分，而且滴度僅能達(dá)到IX1〇7化/mU實(shí)驗(yàn)室小量制備慢病毒一般采用高速離屯、或超濾濃 縮管方法，但運(yùn)些方法處理量小，不適合大規(guī)模制備，且運(yùn)些簡單方法制備的慢病毒純度和 滴度遠(yuǎn)不能滿足基因治療制劑要求，因此，為解決運(yùn)個(gè)難題，需要開發(fā)一種新的慢病毒純化 制備工藝，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模制備高純度，高滴度的慢病毒載體。為解決未來基因治療中所需 的病毒載體提供了一種高效率的生產(chǎn)方案。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種改良的大規(guī)模獲得高純度，高活性慢 病毒的工藝方法，包括W下幾個(gè)步驟： 步驟A:收集慢病毒原液，過濾去除細(xì)胞碎片，澄清后的樣品用于DEAE弱陰離子純化柱 上樣。
[0007]步驟B:通過DEAE弱陰離子純化柱純化： 步驟C:將收集的初純病毒液加入超濾系統(tǒng)樣品杯，再通過凝膠過濾純化柱純化； 步驟D:用過濾除菌，取適量樣品進(jìn)行純度檢測(cè)，感染滴度檢測(cè)。
[000引優(yōu)選的，所述步驟A中，采用0. 8/0. 45ym囊式濾器。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟B中，包括： 步驟Bl:用水沖洗DEAEFF弱陰離屯、純化柱； 步驟B2:再用上樣緩沖液平衡該弱陰離純化柱； 步驟B3:將澄清后的病毒原液上樣； 步驟B4:用上樣緩沖液沖洗該弱陰離純化柱，直至基線平穩(wěn)，W除非特異性結(jié)合的蛋 白； 步驟B5:用低鹽洗脫液沖洗純化柱，W去除非特異性結(jié)合的蛋白； 步驟B6:用洗脫液沖洗純化柱，收集目的病毒，即為初純病毒液； 步驟B7:用水和無水乙醇沖洗純化柱。
[0010] 優(yōu)選的，所述步驟C中，超濾系統(tǒng)樣品杯中生物累轉(zhuǎn)速為50轉(zhuǎn)/分鐘。
[0011] 優(yōu)選的，所述步驟C中，凝膠過濾純化柱純化包括W下幾個(gè)步驟： 步驟Cl:采用PBS緩沖液平衡凝膠過濾柱； 步驟C2:用濃縮后的樣品上樣，再用PBSBuffer沖洗，收集第一個(gè)分離峰。
[0012] 優(yōu)選的，采用0. 22ymPVDF針頭濾器過濾除菌。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟B2和B4中的緩沖液為50mlTris-HCl,質(zhì)量濃度為2%薦糖， pH=7. 5,步驟B5中緩沖液為50mlTris-肥1，150mM化Cl,質(zhì)量濃度2%薦糖抑=7. 5,步驟 B6中，緩沖液為50mlTris-肥1，IM化Cl,質(zhì)量濃度2%薦糖，pH=7. 5。
[0014]其中，50ml Tris-肥1，質(zhì)量濃度為2%薦糖，pH=7. 5,是指：Tris-肥1占整 個(gè)所述緩沖液中濃度為50ml，pH=7. 5,薦糖占整個(gè)緩沖液的質(zhì)量濃度為2% ;50ml 化is-肥l，150mM化Cl,質(zhì)量濃度2%薦糖抑7. 5,是指化is-肥1占整個(gè)所述緩沖液中濃 度為50ml，pH=7. 5，化Cl占整個(gè)所述緩沖液的濃度為150mM;50ml Tris-肥1，SOOmM 化Cl,質(zhì)量濃度2%薦糖，pH7. 5,是指化is-肥1占整個(gè)所述緩沖液中濃度為50ml，化Cl 占整個(gè)所述緩沖液的濃度為500mM，薦糖占整個(gè)緩沖液的質(zhì)量濃度為2%; 優(yōu)選的，所述步驟B1、B2、B7和B8的流速為3cm/min，所述步驟B3-B6的流速為3cm/ mi打O
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟Cl中的流速設(shè)為Iml/min。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：通過初級(jí)純化和精細(xì)純化工藝，獲得高純度慢病毒顆粒，純 度達(dá)99%W上；可實(shí)現(xiàn)更高的濃縮倍數(shù)，從而達(dá)到更高的滴度；處理量大，可規(guī)?；a(chǎn)；采 用改良的離子交換層析緩沖液，能保證終產(chǎn)物的高活性，減少純化過程中慢病毒的失活。
[0017]
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明一種實(shí)施例的工藝流程示意圖； 圖2SDS-PAGE檢測(cè)純度，其中Ianel為不含薦糖緩沖液純化的慢病毒樣品，lane2為 含2%薦糖緩沖液純化慢病毒樣品。
[0019] 圖3 :含2%薦糖緩沖液純化的慢病毒樣品感染肥K293細(xì)胞 圖4 :不含薦糖緩沖液純化慢病毒樣品感染肥K293細(xì)胞 圖5.western-blot檢測(cè)P17蛋白含量及SV40IargeT蛋白殘留圖，其中，Lanel, 3: 不含薦糖緩沖液純化終產(chǎn)物；Lane2,4 :含2%薦糖緩沖液純化終產(chǎn)物；A:pl7檢測(cè)顯色后 的化學(xué)發(fā)光圖和相應(yīng)的白光圖；B:SV40IargeT顯色后的化學(xué)發(fā)光圖和相應(yīng)的白光圖。
[0020] 圖 6SDS-PAGE檢測(cè)純度。
[0021] 圖7慢病毒顆粒感染滴度檢測(cè)。
[0022] 圖8western-blot檢測(cè)P17蛋白含量及SV40IargeT蛋白殘留；A為pl7檢測(cè)顯 色后的化學(xué)發(fā)光圖和相應(yīng)的白光圖；B為SV40IargeT顯色后的化學(xué)發(fā)光圖和相應(yīng)的白光 圖。
[0023]
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明： 實(shí)施例1 :使用改良緩沖液進(jìn)行DEAE弱陰離子純化柱純化，如圖1所示： 步驟A:收集IL慢病毒原液，用0. 8/0. 45ym囊式濾器過濾去除細(xì)胞碎片，澄清后的樣 品用于DEAE弱陰離子純化柱上樣。
[00巧]步驟B:通過DEAE弱陰離子純化柱純化： 1 .先用200血d地2〇沖洗100血DEAEFF弱陰離子純化柱，流速設(shè)為3cm/min。
[0026] 2.再用200血上樣緩沖液（50mlTris-肥1，質(zhì)量濃度2%薦糖，pH7. 5)平衡該 弱陰離純化柱，流速設(shè)為3cm/min。
[0027] 3.將澄清后的病毒原液上樣，流速設(shè)為2cm/min。
[0028] 4.用IL上樣緩沖液（50mlTris-HCl，質(zhì)量濃度2%薦糖，pH7. 5)沖洗該弱陰離 子純化柱，直至基線平穩(wěn)，W去除非特異性結(jié)合的蛋白，流速設(shè)為2cm/min。
[002引 5.用化低鹽洗脫液（50mlTris-肥1，150mM化Cl,質(zhì)量濃度2%薦糖，pH=7. 5) 沖洗純化柱，W去除非特異性結(jié)合的蛋白，流速設(shè)為2cm/min。
[0030] 6.用 500ml洗脫液（50mlTris-肥 1，SOOmM化Cl,質(zhì)量濃度 2%薦糖，pH=7. 5)沖 洗純化柱，收集目的病毒，即為初純病毒液，流速設(shè)為2cm/min。
[0031] 7.用ILd地2〇沖洗純化柱，流速設(shè)為3cm/min。
[003引8.最后用IL20%的無水乙醇沖洗純化柱，流速設(shè)為3cm/min。
[003引步驟C:超濾濃縮：將收集的50血初純病毒液加入超濾系統(tǒng)（100KD)樣品杯，生物 累轉(zhuǎn)速設(shè)置為50轉(zhuǎn)/分鐘，期間更換兩次PBS緩沖液，通過S-500皿凝膠過濾純化柱純 化： 1.先用240mlPBS緩沖液平衡凝膠過濾柱，流速設(shè)為Iml/min。
[0034] 2.用濃縮后的樣品30血上樣，再用PBSBuffer沖洗，流速設(shè)為Iml/min。
[003引 3.收集第一個(gè)分離峰，樣品約IOmL,即濃縮100倍。
[003引步驟D:用0. 22umPVDF針頭濾器過濾除菌，取適量樣品進(jìn)行純度檢測(cè)，感染滴度 檢測(cè)，western-blot檢測(cè)P17蛋白含量，western-blot檢測(cè)SV40IargeT蛋白殘留。
[0037] 實(shí)施例2:使用常規(guī)緩沖液進(jìn)行DEAE弱陰離子純化柱純化 步驟A:收集IL慢病毒原液，用0.8/0. 45um囊式濾器過濾去除細(xì)胞碎片，澄清后的樣 品用于DEAE弱陰離子純化柱上樣。
[0038] 步驟B:通過DEAE弱陰離子純化柱純化： 1.先用200血d地2〇沖