專利名稱：一種包含Ipr1巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體的牛胎兒成纖維細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞的構(gòu)建， 特別涉及一種包含Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體的牛胎兒成纖維細(xì)胞。
背景技術(shù)：
結(jié)核分支桿菌是人畜共患的結(jié)核病的致病菌，結(jié)核分枝桿菌分為人型、牛型和禽 型三種類型，三者存在交叉感染現(xiàn)象。牛型結(jié)核分枝桿菌主要侵害牛，牛結(jié)核病是由牛分枝 桿菌所引起的一種人畜共患的的慢性傳染病，其病變特征為病牛逐漸消瘦，在組織器官中 形成結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪樣壞死。牛結(jié)核病因其易傳染，危害嚴(yán)重，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 將其列為B類傳染病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物傳染。美國(guó)首次出現(xiàn)牛結(jié)核病是在1917年， 而英國(guó)、法國(guó)等國(guó)家將牛結(jié)核病處于控制狀態(tài)，而我國(guó)對(duì)牛結(jié)核病的研究相對(duì)比較滯后，我 國(guó)2003年在廣東發(fā)生了奶牛結(jié)核病，一度還引起市民恐慌，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。對(duì)于結(jié)核病的診斷有細(xì)菌學(xué)診斷和血清學(xué)診斷(包括一些分子生物學(xué)的方法)。 對(duì)于結(jié)核病的預(yù)防，人的結(jié)核病在預(yù)防時(shí)可以使用卡介苗和結(jié)核DNA疫苗等；但是對(duì)于牛 結(jié)核病的疫苗還沒(méi)有商品化使用，因此不能通過(guò)免疫來(lái)預(yù)防。所以，牛結(jié)核病的發(fā)病率高， 只能加強(qiáng)對(duì)牛的檢疫，一旦發(fā)現(xiàn)結(jié)核病陽(yáng)性牛一律采取撲殺的原則。目前對(duì)牛結(jié)核病的治 療只能采用抗生素治療，如鏈霉素、卡那霉素等。但是，長(zhǎng)期使用抗生素不但會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生 抗藥性，還存在牛奶中藥物殘留的問(wèn)題，所以尋求一種新的治療結(jié)核病的方法迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展與完善，為動(dòng)物抗病育種提 供了新的思路，20世紀(jì)80年代采用原核注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但該方法存在外源基因的隨 機(jī)整合和配子系傳送外源基因的不確定性，限制了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。胚胎干細(xì)胞體細(xì) 胞可以代替原核注射，但是在家畜上胚胎干細(xì)胞還沒(méi)有建系，因此也不能得到廣泛的應(yīng)用。 隨著Dolly羊的誕生，體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因結(jié)合克隆技術(shù)培育優(yōu)良動(dòng)物品種一度成為基因工程的隹占。體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力(GOO J, et al. An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cellstransfected with human alpha 1-antitrypsin gene[J]. Theriogenology,2006, 65 (9) 1800-1812.)，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移在體細(xì)胞培養(yǎng)階段進(jìn)行，直接利用已確定的 整合有目的基因的體細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植(SCNT)，這樣體細(xì)胞核移植前供體細(xì) 胞的選擇不但可以提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出生率還可以降低其生產(chǎn)成本(WHEELER MB,WALTERS EM. Transgenictechnology and applications in swine[J]. Theriogenology,2001,56 1345-69.)。2006年，美國(guó)科學(xué)家Maga等培育出在乳腺中特異表達(dá)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山 羊(Maga E A etal Consumption of milk from transgenic goat expressionhuman lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinalmicrofluro[J]. Transgenic Ras，2006，15 :515_519)。2009年，西北農(nóng)林科技大學(xué)生物工程研究所培育出
3在乳腺中特異表達(dá)人防御素的轉(zhuǎn)基因奶牛?，F(xiàn)在對(duì)于體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因和克隆技術(shù)掌握的比較 成熟。2005年pan等發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的發(fā)生是與胞內(nèi)病原體抗性基因l(Iprl)有關(guān)，該研 究證明對(duì)結(jié)核桿菌易感的動(dòng)物是由于機(jī)體沒(méi)有Iprl表達(dá)，且該基因僅在巨噬細(xì)胞中表達(dá) (Pan H，et al. Iprl gene mediates innate immunity toTuberculosis[J] Nature，2005， 434(7034) :767-772)。這為研究防治結(jié)核病提供了新的可能利用體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞 克隆相結(jié)合的方式，使得缺少Iprl表達(dá)的牛通過(guò)生物技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)Iprl表達(dá)，以達(dá)到抗結(jié) 核病的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種包含Iprl巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體，以及基于該 載體的包含包含Iprl巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體的牛胎兒成纖維細(xì)胞系，利用該細(xì)胞系作為 核供體細(xì)胞，為解決奶牛結(jié)核病的轉(zhuǎn)基因奶牛提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，包含目的基因Iprl，在Iprl基因的5'端插 入如SEQ. ID. NO. 1所示的sp啟動(dòng)子序列。所述的Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，還包含抗生素篩選基因和標(biāo)記基因。所述的抗生素篩選基因?yàn)閚eo基因，所述的標(biāo)記基因?yàn)镋GFP基因。所述的Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體為Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體。所述的Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體，先通過(guò)EC0R1和Pstl多克隆位點(diǎn)將Iprl基因 克隆到pSRA-EGFP載體上，然后再通過(guò)Bglll和EC0R1I多克隆位點(diǎn)將sp啟動(dòng)子克隆到 pSRA-EGFP載體上而得到。一種包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞，其宿主細(xì)胞為牛胎兒成纖維細(xì)胞， 通過(guò)轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl，將目的基因Iprl整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基 因組。所述的宿主細(xì)胞為3 10代的牛胎兒成纖維細(xì)胞。所述的牛胎兒成纖維細(xì)胞通過(guò)電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl。包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞為重組荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì) 胞-Psp-EGFP-Iprl，該細(xì)胞保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCC201005。所述的包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的 核供體細(xì)胞的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明構(gòu)建了一種Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，通過(guò)在Iprl基因5'插入 sp啟動(dòng)子，使得目的基因Iprl在牛的巨噬細(xì)胞中特異的高效表達(dá)。2、本發(fā)明將目的基因Iprl克隆到基礎(chǔ)載體Psp-EGFP上，構(gòu)建了 Iprl巨噬細(xì)胞 特異性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl，將其轉(zhuǎn)染到牛胎兒成纖維細(xì)胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的牛胎兒成纖 維細(xì)胞系；熒光顯微觀察標(biāo)記基因EGFP的表達(dá)情況，并經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，并進(jìn)行 PCR鑒定證實(shí)目的基因Iprl整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組。3、以包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞，通過(guò)SCNT獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚，將這些胚胎移入受體牛的子宮有望生產(chǎn)出轉(zhuǎn)Iprl 基因的牛，該轉(zhuǎn)基因?？深A(yù)防結(jié)核病的發(fā)生。保藏說(shuō)明保藏說(shuō)明本發(fā)明對(duì)所述的重組荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞-Psp-EGFP-Iprl，進(jìn)行了下述保 藏保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢市武昌珞珈山，保藏時(shí)間 2010年3月28日；保藏號(hào)為CCTCC C201005，分類命名為重組荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì) 胞-Psp-EGFP-Iprl。


圖1是EC0R1和Pstl雙酶切鑒定pTAIprl載體的結(jié)果圖；圖2是巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl的質(zhì)粒圖譜；圖3是PCR擴(kuò)增的sp啟動(dòng)子序列的電泳鑒定結(jié)果圖；圖4是Bglll和BamHl雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒Psp-EGFP-Iprl的結(jié)果圖；圖5是熒光顯微鏡觀察Psp-EGFP-Iprl載體陽(yáng)性表達(dá)的重組牛胎兒成纖維細(xì)胞的 結(jié)果圖；圖6是對(duì)Psp-EGFP-Iprl載體陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組的Iprl基因 擴(kuò)增之后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；圖7是包含Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體的重組胚的囊胚發(fā)育圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先構(gòu)建含有Iprl和綠色熒光蛋白(EGFP)基因的巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載 體Psp-EGFP-Iprl，然后用電轉(zhuǎn)染法將外源性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl導(dǎo)入牛胎兒成纖維 細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記基因EGFP的表達(dá)情況，并經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒 定，證實(shí)目的基因Iprl整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組；最后，將轉(zhuǎn)染Iprl基因的牛胎 兒成纖維細(xì)胞作為核供體移入牛去核卵母細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚。具體所涉及的試劑和材料如下G418、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBICO (Invitrogen) 公司，EDTA和Trypsin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自中國(guó)杭州四季青公司，細(xì)胞培養(yǎng) 板和培養(yǎng)皿為丹麥Nimclon公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒和細(xì)胞基因組提取試劑盒均購(gòu)自天 根公司，Hot start DNA聚合酶和T4DNA連接酶購(gòu)自Takara公司，電轉(zhuǎn)染儀(ECM2001)購(gòu) 自美國(guó)BTX公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自MBI公司。C57BL/6J鼠購(gòu)自西安交大醫(yī)學(xué)院，總RNA提
式齊自 promega 。0pti_MEM I Reduced Serum Media ^ g Invitrogen ^ 司。下面結(jié)合附圖和實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明解釋的而不 是限定。1、巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl的構(gòu)建1. 1目的基因Iprl的克隆根據(jù)GenelD :AY845948所公布的Iprl基因序列設(shè)計(jì)引物P1和P2，提取C57小鼠的肺組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引 物對(duì)序列如下正向弓丨物 PI :aggaacccct taactaatcc aggca 25;反向弓丨物 P2 :gctgggacac tcagaggctc aaag 24;25 ii L 的 PCR 反應(yīng)體系為10XPCR Buffer :5u L, dNTP (2. 5mmol/L) :2u L, PI (10 u mol/L) :luL,P2 (10 u mol/L) : 1 ii L，LA 酶0. 3 ii L，模板 1 ii L,加超純水至 25 u L。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30s，64. 4°C退火45s，72°C延伸 2min, 35 個(gè) PCR 循環(huán)；72°C再延伸 lOmin ；將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-18T在4°C過(guò)夜連接，過(guò)夜后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 a，通過(guò)a -互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，搖菌、提質(zhì)粒，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTAIprl。經(jīng) EC0R1和Pstl雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTAIprl并送交南京金斯特公司測(cè)序。酶切鑒定的結(jié)果如圖1所示，其中泳道A為陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTAIprl，泳道M為 Maker，可以看到pTAIprl載體被雙酶切之后可以看到1614bp的目的條帶。載體pTAIprl 測(cè)序結(jié)果顯示，Iprl的測(cè)序與GenelD 公布的Iprl基因序列(AY845948)的⑶S區(qū)同源性 為100%，至此，Iprl基因克隆成功。1. 2Psp-EGFP-Iprl的載體結(jié)構(gòu)及其構(gòu)建過(guò)程包含目的基因Iprl、作為調(diào)控元件的sp啟動(dòng)子序列，以及抗性篩選基因(neo)和 標(biāo)記基因EGFP的巨噬細(xì)胞特異性載體Psp-EGFP-Iprl，其元件排列如圖2所示其中，sp啟動(dòng)子下游為目的基因Iprl，Iprl基因的下游為SV40PolyA和抗性篩選 基因neo，而標(biāo)記基因EGFP位于CMV啟動(dòng)子的下游，篩選基因neo和標(biāo)記基因EGFP應(yīng)用于 篩選Psp-EGFP-Iprl被整合的重組細(xì)胞；sp啟動(dòng)子是巨細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，這樣sp啟動(dòng)子 就能夠指導(dǎo)目的基因Iprl在牛巨噬細(xì)胞中特異性的表達(dá)。本發(fā)明具體將克隆到的目的基因和調(diào)控元件分別與不同的載體連接，然后在通過(guò) 多克隆位點(diǎn)構(gòu)建到一起，具體是以psp-EGFP載體和pSRA-EGFP-Iprl載體為骨架載體進(jìn)行構(gòu)建。1.2.1 psp-EGFP 載 體(Macrophage-specific overexpression of antimicrobialpeptide PR-39 inhibits intracellular growth of Salmonella enterica serovarTyphimuriumin macrophage cells)是一種包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的表達(dá)載 體，其中包括sp啟動(dòng)子；本發(fā)明以該載體作為sp啟動(dòng)子的克隆模板，具體的克隆如下以psp-EGFP為模板用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，引物對(duì)為XEl^l 弓 L P3 :gaagatctta ataaaagcga cttcctcttt ccagcagaaa agga 44 ；反向弓|物 P4tagcgactgg gtggcctcca gtgctccc38;弓丨物P3、P4當(dāng)中的劃線部分分別為Bglll和EC0RI酶切位點(diǎn)；PCR 反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5min ；95°C變性 30s，71. 1°C退火 30s，72°C延伸 30s， 30個(gè)PCR循環(huán)；72 °C再延伸7min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳的結(jié)果如圖3所示，其中，泳道M為Maker，泳道A為 PCR擴(kuò)增的sp啟動(dòng)子序列，可以看到PCR擴(kuò)增了 346bp的sp啟動(dòng)子序列，其具體的核苷酸 序列如SEQ. ID. NO. 1所示。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后，以Bglll/ECORI雙酶切后，膠回 收純化帶有黏性末端的片段。
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1. 2. 2pEGFP-Cl載體包含G418抗性篩選基因neo和帶有CMV啟動(dòng)子的標(biāo)記基因 EGFP，該載體商購(gòu)就可以獲得；pEGFP-Cl載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，標(biāo)記基因EGFP被表達(dá) 后產(chǎn)生綠色熒光。本發(fā)明通過(guò)多克隆位點(diǎn)E⑶R1和Pstl將目的基因Iprl插入到pEGFP_Cl載 體上；而目的基因的調(diào)控區(qū)還包含polyA加尾信號(hào)及控制轉(zhuǎn)錄終止的G/T簇，這些序列 結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄、在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定性及介導(dǎo)其翻譯調(diào)控起到重要的作用，具體由 pSRA-EGFP-Iprl載體來(lái)提供。pSRA-EGFP-Iprl 載體構(gòu)建如下將克隆的到的Iprl序列和pEGFP-Cl分別用EcoRI和Pstl雙酶切，回收小片段和 載體大片段，T4DNA連接酶過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a，次日挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒 用EcoRI/Pst酶切鑒定，正確的命名為pEGFP-Cl-Iprl。以人血液基因組為模板，根據(jù)SR-A啟動(dòng)子位于主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-245 +46之間，擴(kuò)增產(chǎn)物291bp，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)，所述的擴(kuò)增引物對(duì)為iHfel 弓 L P5 :RaaRatctta ataaccactg cactccaccc tggtgagac 39;反向弓丨物 P6atagtatttc agcatctggt ac32;在正向引物P5的5，端加Bglll酶切位點(diǎn)和TAATAA，在反向引物P65，端加EcoRI 酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)注為酶切位點(diǎn)。PCR條件為94°C變性30s ；59°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，膠回收符合目的基因大小的條帶。把pEGFP-Cl-Iprl和SRA分別用Bglll和EcoRI雙酶切，回收SR-A酶切產(chǎn)物和 pEGFP-Cl-Iprl大片段，T4DNA連接酶過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，次日挑取陽(yáng)性克 隆，提取質(zhì)粒用Bglll/PstI雙酶切鑒定，正確的命名pSRA-EGFP-Iprl。1. 2. 3在骨架載體構(gòu)建完成之后，Psp-EGFP-Iprl載體的構(gòu)建如下將pSRA-EGFP-Iprl 用 Bglll 和 EC0RI 雙酶切，雙酶切體系為pSRA-EGFP_Iprl 20 u L, Bglll :2u L, ECORI L，加超純水至 40u L0將Bglll和ECORI雙酶切的pSRA-EGFP-Iprl載體大片段，和經(jīng)Bglll和ECORI雙 酶切后的sp啟動(dòng)子序列片段，用T4 DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，連接完成之后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞E.coli DH5a，通過(guò)a -互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，提取質(zhì)粒后用Bglll和BamHl 雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒；鑒定結(jié)果如圖4所示，其中泳道M為Marker ；泳道A為Bglll和 BamHl雙酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，可以看到大約4700bp和1960bp的兩條條帶，4700bp條帶 為酶切的pEGFP-Cl載體大片段，1960bp的條帶為sp啟動(dòng)子和Iprl基因序列片段；將獲得 的重組質(zhì)粒命名為Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體。由于質(zhì)粒在大腸桿菌中增殖，用普通的質(zhì)粒提取方法容易將細(xì)菌內(nèi)毒素帶到終產(chǎn) 物中，細(xì)菌內(nèi)毒素的存在會(huì)影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生長(zhǎng)，所以本發(fā)明使用了去內(nèi)毒素的 質(zhì)粒提取試劑盒，以減少內(nèi)毒素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的負(fù)面影響。用promega公司的去內(nèi)毒素的質(zhì) 粒純化試劑盒提取質(zhì)粒后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，經(jīng)測(cè)定，質(zhì)粒的濃度 為508. 3ng/u 1, 0D260/280為2. 12，說(shuō)明質(zhì)粒較純，可用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。2、Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞構(gòu)建核供體細(xì)胞系2. 1牛胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
從液氮中取一管第三代荷斯坦奶牛的牛胎兒成纖維細(xì)胞于38°C解凍，離心。棄去 廢液，加3ml細(xì)胞懸浮液(含10% FBS的DMEM)重懸，接種于60mm的培養(yǎng)皿中(含10% FBS的DMEM)，置于C02培養(yǎng)箱中37°C條件下培養(yǎng)。待牛胎兒成纖維細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS沖洗細(xì) 胞，加入胰酶與EDTA混合消化液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。待大多數(shù)細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙 擴(kuò)大時(shí)，用等體積含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打混勻后，離 心收集，懸浮，按1 3的比例接種于60mm培養(yǎng)皿，放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取3 10代 傳代的細(xì)胞達(dá)到90%匯合的牛胎兒成纖維細(xì)胞，作為用于轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明以G418作為篩選藥物，由于表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl的骨架上有G418抗 性基因neo，外源基因Psp-EGFP-Iprl得到表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞能夠在含有一定濃度 G418的培養(yǎng)液中存活下來(lái)，而未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞會(huì)在該濃度下死亡，因此需要確定正常細(xì) 胞G418的最小致死濃度來(lái)作為篩選濃度。G418最小致死濃度的測(cè)定在牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)中分 別加入濃度梯度的G418篩選1周，測(cè)定正常細(xì)胞的G418最小致死濃度。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中 G418的濃度大于或等于600ii g/ml時(shí)，在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞全部死亡，所以G418的最小致 死濃度為600ii g/ml。2. 2Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的方法有很多種，包括電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、病毒載體法、受體 介導(dǎo)法等。本發(fā)明具體采用電轉(zhuǎn)染法，將表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞。細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，消化細(xì)胞后離心(1000r/min，4min)收集細(xì)胞，然后用 Opti-MEM I Reduced Serum Media洗滌細(xì)胞2次，每次清洗的過(guò)程中要輕輕慢慢的吹 打細(xì)胞，防止細(xì)胞受到損害，將電轉(zhuǎn)染液(cell鹽opti = 3 lV/V;cell鹽Kcl :120mm; Cacl2 0. 15mm ；K2HP04 10mm ；Mgcl2 :50mm ；調(diào) PH 至 7. 6 ；opti 艮口 Opti-MEM I Reduced Serum Media)和表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl (20 y g)的混合液(800 yl)加到經(jīng)離心棄去培養(yǎng) 液的離心管中(加完質(zhì)粒后加opti至800 yL)，輕輕吹打細(xì)胞，使其完全吹散，混勻。將上 述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到BTX電擊杯中(4mm間隙，黃色蓋子，800 y L容積)，靜置lOmin ；將電轉(zhuǎn) 染參數(shù)設(shè)置如下電壓500V ；脈沖時(shí)間1ms ；電擊次數(shù)3次，靜置完成之后進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染完成后，細(xì)胞靜置lOmin，然后將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移到60mm培養(yǎng)皿中；加入 37°預(yù)溫的含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液3mL，將培養(yǎng)液置于37°、5%的C02培養(yǎng)箱 中，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液(培養(yǎng)液中含有電轉(zhuǎn)染液影響細(xì)胞生長(zhǎng))，換成經(jīng)37°溫育 的DMEM完全培養(yǎng)液4mL，24h后加入G418至終濃度為600 u g/ml。2. 3Psp-EGFP-Iprl載體陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞篩選Psp-EGFP-Iprl轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞24h后，在含血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中添 加600 u g/ml的最小致死濃度的G418篩選；以未轉(zhuǎn)染Psp-EGFP-Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞 為陰性對(duì)照，其細(xì)胞培養(yǎng)液加有同樣濃度的G418 (600 y g/ml)。Psp-EGFP-Iprl轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，表達(dá)載體被表達(dá)之后能夠在熒光顯微鏡下 可以看到綠色熒光。當(dāng)轉(zhuǎn)基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)出如圖5所示的綠色熒光，說(shuō)明 Psp-EGFP-Iprl已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞并且陽(yáng)性表達(dá)；Psp-EGFP-Iprl轉(zhuǎn)染細(xì)胞7d后，對(duì)照組的細(xì)胞 全部死亡，將包含Psp-EGFP-Iprl轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的細(xì)胞組的G418濃度減半持續(xù)篩選直到細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底，可見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞形成島嶼狀細(xì)胞群，在熒光顯微鏡下仍然可以看到綠色熒光；然后 消化細(xì)胞用不加G418的正常培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明篩選的陽(yáng)性細(xì)胞都是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Psp-EGFP-Iprl的細(xì)胞，目的基因Iprl整合 到細(xì)胞的基因組上，而不是游離于基因組之外；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，質(zhì)粒Psp-EGFP-Iprl 上攜帶的基因會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組上；通過(guò)G418篩選7天再半劑量持續(xù)篩選來(lái)達(dá)到 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的，表現(xiàn)為報(bào)告基因在被轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，因此篩選的陽(yáng)性細(xì)胞 持續(xù)發(fā)出綠色熒光并呈現(xiàn)G418抗性。以上構(gòu)建的通過(guò)整合Psp-EGFP-Iprl載體到細(xì)胞基因組，得到包含目的基因Iprl 的荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞。2. 4Psp-EGFP-Iprl載體陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的PCR鑒定取擴(kuò)大培養(yǎng)后的Psp-EGFP-Iprl陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組 DNA，以基因組DNA為模板，PCR鑒定Iprl基因是否整合到細(xì)胞基因組中，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn) 染的正常牛胎兒成纖維細(xì)胞，PCR鑒定所用引物對(duì)為P1和P2 ；PCR 反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 5min ；95°C變性 30s，64°C退火 40s，72°C延伸 2min， 35個(gè)PCR循環(huán)；72°C再延伸lOmin ；回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié) 果如圖6所示，其中，泳道1為DNAMarker，泳道2為Psp-EGFP-Iprl轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì) 胞，泳道3為未轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞，泳道2與泳道3相比，明顯可以看到一條1600bp 左右的條帶(目的基因Iprl為1614bp)，而作為陰性對(duì)照的泳道3并沒(méi)有看到，說(shuō)明目的基 因Iprl整合到了宿主細(xì)胞牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組。當(dāng)Iprl基因整合到了宿主細(xì)胞牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組，sp啟動(dòng)子、EGFP與目 的基因Iprl也會(huì)一起整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組。本發(fā)明對(duì)經(jīng)過(guò)重組篩選和重組細(xì)胞的PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)染了表達(dá)載體 Psp-EGFP-Iprl的陽(yáng)性重組細(xì)胞，送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行保藏，分類命 名為重組荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞-Psp-EGFP-Iprl，保藏號(hào)為CCTCC C201005。3、以上述基因組整合了目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞為核供體細(xì)胞，構(gòu)建 轉(zhuǎn)基因克隆胚3. 1卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)卵巢采自西安市屠宰場(chǎng)，無(wú)菌采取荷斯坦奶牛卵巢，在37°C無(wú)菌生理鹽水中4 6 小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，抽取3 8mm直徑的卵泡，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，實(shí)體顯微鏡下挑 選具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞，胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞用于成熟培養(yǎng)。卵母細(xì)胞的成熟培 養(yǎng)液為TCM199(Gibico)加10%胎牛血清，10ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)條件為38. 5°C, 5% C02、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和濕度；成熟培養(yǎng)20h后用0. 2%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì) 胞，以第一極體的排放作為卵母細(xì)胞成熟的判定標(biāo)志，挑選成熟卵母細(xì)胞用于核移植試驗(yàn)。3. 2轉(zhuǎn)基因克隆胚的構(gòu)建采用體細(xì)胞核移植(SCNT)技術(shù)將供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去除細(xì)胞核的成熟卵母細(xì)胞 中，其中，整合有外源基因的供體細(xì)胞是關(guān)鍵，本發(fā)明將供體細(xì)胞控制到10代以內(nèi)，這主要 考慮減少體外培養(yǎng)導(dǎo)致的突變?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中的積累。核移植具體為顯微操作液為含10% FBS,5ug/ml細(xì)胞松弛素B的PBS，用內(nèi)徑 20 um的去核管在顯微操作儀上吸出第一極體及部分胞質(zhì)，以10 ii g/mlHoechst 33342染色lOmin，在熒光顯微鏡下挑出完全去核的卵母細(xì)胞；完全去除第一極體及染色體的卵母 細(xì)胞被用于核移植。卵母細(xì)胞的注核與融合，具體過(guò)程如下0. 25%胰蛋白酶消化接觸抑制3d的6 10代的轉(zhuǎn)染Psp-EGFP-Iprl的荷斯坦牛胎兒成纖維細(xì)胞用做供核細(xì)胞。用去核管將供體細(xì) 胞注入去核成功的卵母細(xì)胞透明帶下。核質(zhì)復(fù)合體在電融合液中平衡3min，用微電極法進(jìn) 行融合，用與顯微操作儀連接的微電極尖部排列重組體，使膜接觸面與兩電極的連線垂直， 用微電極尖輕輕壓住重組體，給予電脈沖進(jìn)行電融合。融合電壓為28V，融合時(shí)間為lOym。 融合后的重組體放入10% FBS的M199中，38. 5°C,5% C02、飽合濕度下培養(yǎng)，2h后觀察融合 情況。3. 3轉(zhuǎn)基因克隆胚的激活及體外培養(yǎng)融合的重組胚在含10% FBS的M199中平衡2h后，用含5 y mol/L離子霉素 (Ionomycin,購(gòu)自SIGMA公司)的mSOFaa培養(yǎng)液(購(gòu)自SIGMA公司)處理5min，然后在含 2mmol/L 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4h，清洗3次后轉(zhuǎn)入礦物油覆 蓋并預(yù)先在C02培養(yǎng)箱中平衡至少2h的mSOFaa中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為5 u L每個(gè)重組胚，在 38. 5°C,5% C02、飽和濕度下培養(yǎng)，第7 9天檢查囊胚發(fā)育情況，如圖7所示，克隆胚正常 發(fā)育至囊胚，圖中黑色部分為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，外圍為滋養(yǎng)層細(xì)胞。而整合了巨噬細(xì)胞特異性表達(dá) 載體Psp-EGFP-Iprl的轉(zhuǎn)基因克隆胚的構(gòu)建成功，為預(yù)防牛結(jié)核病提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。核苷酸序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌科元克隆股份有限公司<120> 一種包含Iprl巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體的牛胎兒成纖維細(xì)胞<160>2<210>1<211>352<212>DNA<213>人工合成的sp啟動(dòng)子<400>1
0109]ttcgctgaaggagaaaggtcgtcttttcctcttcatcctcggttctaaaggtttgagaca600110]ccaacggaacttcgctgaaggagaaaggtcttcgctgaaggagaaaggtcgtcttttcct1200111]cttcatcctcgaggatgaagaggaaaagacggttctaaaggtttgagacaccaacggaac1800112]gaggatgaagaggaaaagacgtcttttcctcttcatcctcgacctttctccttcagcgaa2400113]atgggagggacgggggacagggctggcgctgttttcgctgaaggagaaaggtcacgtaaa3000114]ttccgcgtcggaccttcacggtccctcgtgacctccggtgggtcagcgateg352<210>2<211>1614<212>DNA<213>人工合成的Iprl基因<400>2aggaacccct taactaatcc aggcagtgac ctgggagaac tcgggagaac ccgtggcagc 60cctcagcatc caggatgttc actctgacca aagccttgga aaaggctctt ctccagcatt 120
10
tcatatacatgaaggtgaacatcgcctatgCC3.tC3-3.C3.3.gccattccccttcttcgaag180
cgctccgggacaattccttcatcactgagagaatgtacaaggaatctctggaagcctgtc240
aaaatctggtccctctgtccaaagtggtgcacaatattctcaccagtctggagcagactt300
tccacccgtcagtgctgctgacgttgttcagcaaggtcaacctccgggaataccccagcc360
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ccccactgaccctgcttgaagacctggccaacccagcagaagggtgctcccttcagacac480
tgctgccaccaccccgaccccagatatcgctgccaagtcatctgtcctcagcaccgagag540
tctgtgaccccagagcaaccgcacagccaatcattgagatcctggatgagcagcccagtc600
cttctccccgagctgtgcctctccttggctgcattcaggaaggaaaaaccactccagtgt660
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cagctcctgtgctcgctcgcactctgtctctgtctctctgtctctctctgtctctctcta1500
tctctgtctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctgtgtgtgtgtgtg1560
tgtgtgtgtgtgtgtgtgtctgaactttgcctttgagcctctgagtgtcccagc161權(quán)利要求
一種Ipr1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于，包含目的基因Ipr1，在Ipr1基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.1所示的sp啟動(dòng)子序列。
2.如權(quán)利要求1所述的Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于，Iprl巨噬細(xì)胞特 異性表達(dá)載體還包含抗生素篩選基因和標(biāo)記基因。
3.如權(quán)利要求2所述的Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的抗生素篩 選基因?yàn)閚eo基因，所述的標(biāo)記基因?yàn)镋GFP基因。
4.如權(quán)利要求1所述的Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的Iprl巨噬 細(xì)胞特異性表達(dá)載體為Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的Iprl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的 Psp-EGFP-Iprl表達(dá)載體，先通過(guò)ECORl和Pstl多克隆位點(diǎn)將Iprl基因克隆到pSRA－EGFP 載體上，然后再通過(guò)BglII和ECORI多克隆位點(diǎn)將sp啟動(dòng)子克隆到pSRA_EGFP載體上而得 到。
6.一種包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞，其特征在于，其宿主細(xì)胞為牛胎兒成 纖維細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl，將目的基因Iprl整合到牛胎兒成纖 維細(xì)胞的基因組。
7.如權(quán)利要求6所述的包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞，其特征在于，所述的 宿主細(xì)胞為3 10代的牛胎兒成纖維細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6所述的包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞，其特征在于，所述的 牛胎兒成纖維細(xì)胞通過(guò)電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染外源性表達(dá)載體Psp-EGFP-Iprl。
9.如權(quán)利要求6所述的包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞，其特征在于，包含目 的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞為重組荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞-Psp-EGFP-Iprl，該 細(xì)胞保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC C201005。
10.所述的包含目的基因Iprl的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的 核供體細(xì)胞的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含Ipr1巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體的牛胎兒成纖維細(xì)胞，構(gòu)建了一種包含Ipr1巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體Psp-EGFP-Ipr1，以及基于該載體的包含包含Ipr1巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體的牛胎兒成纖維細(xì)胞系，利用該細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞，為解決奶牛結(jié)核病的轉(zhuǎn)基因奶牛提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明通過(guò)電轉(zhuǎn)染法將外源性表達(dá)載體Psp-EGFP-Ipr1導(dǎo)入牛胎兒成纖維細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記基因EGFP的表達(dá)情況，并經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定，證實(shí)目的基因Ipr1整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組；最后，將轉(zhuǎn)染Ipr1基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體移入牛去核卵母細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101851638SQ20101014299
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者何小寧, 蘭杰, 劉軍, 華松, 宋永利, 張涌, 王勇勝, 賀小英 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué);楊凌科元克隆股份有限公司