專利名稱：：一種整合牛nramp1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體/牛成纖維細(xì)胞及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞的構(gòu)建，特別涉及到一種整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體的牛成纖維細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：布氏桿菌病(Brucellosis)是由布氏桿菌(Brucellaabortus)引起人畜共患的一種慢性傳染病，其臨床特點(diǎn)主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、長(zhǎng)期發(fā)熱、睪丸炎、腱鞘炎和關(guān)節(jié)炎等，病理特征為全身彌漫性網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生和肉芽腫結(jié)節(jié)形成。本病所累及的組織器官很廣泛，以單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等最為常見(jiàn)。布氏桿菌為細(xì)小的短桿狀或球桿狀，不產(chǎn)生芽胞，革蘭氏陰性的桿菌。病原布氏桿菌共分為牛、羊、豬、沙林鼠、綿羊和犬布氏桿菌六種。病原菌主要通過(guò)體表皮膚粘膜的接觸傳播，亦可通過(guò)消化道傳播，且可以通過(guò)含有布氏桿菌的氣溶膠感染人或動(dòng)物。布氏桿菌病嚴(yán)重地危害人類的身心健康并影響畜牧業(yè)的發(fā)展。人感染布病常常是緩慢發(fā)病，輕度感染者僅感到疲乏，頭痛，關(guān)節(jié)肌肉酸痛，或無(wú)任何自覺(jué)癥狀，典型病例表現(xiàn)體溫?zé)嵝统什ɡ藸?、寒顫、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛、睪丸炎、滑囊炎、腱鞘炎，個(gè)別患者關(guān)節(jié)硬化。人患布氏桿菌病后嚴(yán)重影響人的生活和生育能力。布病引起雌性動(dòng)物流產(chǎn)、不孕等癥狀，母畜流產(chǎn)后多伴發(fā)胎衣停滯和子宮內(nèi)膜炎，影響妊娠并導(dǎo)致不育。布病可引起雄性動(dòng)物則出現(xiàn)睪丸炎和附睪炎，導(dǎo)致配種能力降低，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。在世界200多個(gè)國(guó)家和地區(qū)中，170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有布氏桿菌病存在和流行。約占世界1/5-1/6的人口受布病的威脅，全世界現(xiàn)約有500-600萬(wàn)人患布氏桿菌病，年新發(fā)病人約有50萬(wàn)(布合麗切木依干巴地，等.布魯氏桿菌病的危害及其防治.草食家畜，2007，3:60-61)。在中國(guó)有25個(gè)省(市)、自治區(qū)有布氏桿菌病存在和流行，1200多個(gè)縣市為布魯氏桿菌病疫區(qū)，約有3.5億人遭受布氏桿菌病威脅，(尚德秋.布魯氏桿菌病研究進(jìn)展·中國(guó)地方病防治雜志，2004，19):204-212)。布氏桿菌在體內(nèi)廣泛分布且是兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，普通藥物不易生效。目前對(duì)于本病的治療尚無(wú)理想的方法，一般采用檢疫、淘汰病畜來(lái)防止動(dòng)物的流行和擴(kuò)散，仍是以預(yù)防為主。在疫苗接種過(guò)程中也存在一系列問(wèn)題(趙富有；等.布氏桿菌病防控及疫苗使用的探討.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2010,3:24-27)，如有些菌苗由于菌株毒力過(guò)大，接種反應(yīng)強(qiáng)烈，有些菌苗效力還不十分理想，有些菌苗不能用于懷孕動(dòng)物，還有的菌苗不能用于成年動(dòng)物、種公畜和患病動(dòng)物等，這些因素限制了菌苗的應(yīng)用，造成接種密度不高而影響防治效果。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)及體細(xì)胞克隆技術(shù)的日臻完善，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法培育抗病新品種動(dòng)物已成為可能。1982年美國(guó)科學(xué)家I^lmiter等將大鼠生長(zhǎng)激素(GH)基因?qū)胄∈笫芫阎蝎@得的轉(zhuǎn)基因“超級(jí)鼠”被認(rèn)為是世界上首批轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(PalmiterRDB.R.，etal.Dramaticgrowthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothionein-growthhormonefusiongenes[J].Nature，1982，300:611-615)。Brophy等Q003)報(bào)道通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)提高牛自身β_酪蛋白基因、κ_酪蛋白基因的拷貝數(shù)，提高了牛奶中酪蛋白和κ-酪蛋白的含量，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法改變牛奶的組成禾口品質(zhì)BrophyB.,G.Smolenski,T.Wheeler,etal.Clonedtransgeniccattleproducemilkwithhigherlevelsofbeta-caseinandkappa-casein[J].NatBiotechnol，2003，21(2):157-62)。日本研究人員Kuroira等Q004)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)免疫球蛋白(Ig)和朊蛋白(PRNP)基因進(jìn)行依次打靶，獲得Ig單基因位點(diǎn)和雙基因位點(diǎn)失活的轉(zhuǎn)基因牛(KuroiwaY.,etal.Clonedtranschromosomiccalvesproducinghumanimmunoglobulin[J].NatBiotechnol,2002,20(9):889-94)。Donovan等Q005)將編碼溶葡球菌酶的基因轉(zhuǎn)入奶?；蚪M中獲得轉(zhuǎn)基因牛，證明了在轉(zhuǎn)基因奶牛的乳腺中表達(dá)的溶葡球菌酶可以有效預(yù)防由葡萄球菌引起的乳房炎(DonovanD.M.，etal.Engineeringdiseaseresistantcattle[J],TransgenicRes，2005，14(5):563-7)。2006年世界首例抗瘋牛病轉(zhuǎn)基因克隆牛在中國(guó)山東淄博誕生(董雅娟等)。同年4月，中國(guó)工程院旭日干院士指導(dǎo)完成國(guó)內(nèi)首例攜帶有人胰島素基因的轉(zhuǎn)基因克隆牛(李惠子等，2006)。2009年8月，西北農(nóng)林科技大學(xué)張涌教授課題組主持培育的世界首例轉(zhuǎn)人防御素基因克隆奶牛降生。轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛的生產(chǎn)技術(shù)體系日趨成熟。人們?cè)谘芯啃∈髮?duì)結(jié)核分枝桿菌、沙門(mén)桿菌和利什曼原蟲(chóng)的易感性時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠的1號(hào)染色體上的顯性基因，決定了小鼠對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原微生物侵染的抗性或易感性，并將該類基因命名為天然抗性相關(guān)巨噬蛋白l(NRAMPl)。Vidal通過(guò)基因敲除的方法敲除NRAMPl基因后，小鼠喪失了抵抗結(jié)核桿菌、沙門(mén)傷寒菌等胞內(nèi)寄生菌的能力(VidalS.M.，etal.Naturalresistancetoinfectionwithintracellularparasites!isolationofacandidateforBcg[J]·Cell，1993，73(3):469-85)。1996年Feng克隆了牛的NRAMPl基因，并定位于牛的第二號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)約111Λ，含有15個(gè)外顯子，編碼的蛋白含有12個(gè)跨膜區(qū)域(FengJ.,etal.Bovinenaturalresistanceassociatedmacrophageprotein1(NRAMPl)gene[J].GenomeRes,1996,6(10):956-64)。Barthel等通過(guò)克隆牛NRAMPl啟動(dòng)子和牛NRAMPl基因，構(gòu)建NRAMPl特異性的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到小鼠7巨噬細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，能夠抑制布氏桿菌的復(fù)制(BarthelR.，etal.StabletransfectionofthebovineNRAMPlgeneintomurineRAW264.7cells:effectonBrucellaabortussurvival[J],Infectlmmun,2001,69(5):3110-9)。這為?？共际蠗U菌病育種提供了可能利用體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因和克隆結(jié)合的方式，增加牛NRAMPl基因的拷貝數(shù)提高NRAMPl在牛巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，以達(dá)到抗布氏桿菌病的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體/牛成纖維細(xì)胞及其方法，其包括含有NRAMPl基因的巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，以及基于該載體的整合有NRAMPl基因的巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體的牛成纖維細(xì)胞系，利用該細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞，為解決秦川牛布氏桿菌病的轉(zhuǎn)基因克隆牛提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特殊之處在于其包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP以及HA標(biāo)簽的目的基因NRAMPl。上述整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特殊之處在于還包括抗性篩選基因neo基因。上述整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特殊之處在于該載體通過(guò)用SacII和BamHI酶切將NRAMPl基因克隆到巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP載體上，然后用BamHI和NotI將EGFP切除掉而獲得。一種含有上述載體的牛成纖維細(xì)胞，其特殊之處在于其宿主細(xì)胞是秦川牛耳朵皮膚成纖維細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將目的基因NRAMPl整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中。上述的宿主細(xì)胞是5-8代的秦川牛耳朵皮膚成纖維細(xì)胞。上述牛成纖維細(xì)胞，其特殊之處在于該牛成纖維細(xì)胞作為核移植共體細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚。一種整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性載體的構(gòu)建方法，其特殊之處在于，該方法包括1)牛NRAMPl基因克隆1.1)在牛NRAMPl基因的開(kāi)放閱讀框首尾兩端設(shè)計(jì)分別含有SacII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物，正向引物IF5，-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3，；反向引物IR5’-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3，；1.2)取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，采用Trizol方法提取脾臟組織中的總RNA，利用cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；1.3)以cDNA為模板，用引物對(duì)IF和1R，用TriplemsastersystemPCR擴(kuò)增牛NRAMPl基因；反應(yīng)條件是95°C，5min；95°C30sec；66°C30sec；72°C2min；36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin；4°C保存；1.4)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，與pGEM-Tfesy載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5ci，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選重組子，對(duì)EcoRI酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為pGEM-T-easy-NRAMPl并用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析；2)牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性載體構(gòu)建2.1)巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP可以在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其中包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP;以pSP-EGFP載體為骨架，通過(guò)插入目的基因NRAMPl并去掉EGFP構(gòu)建NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl-HA；2.2)含NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl_HA的構(gòu)建將pGEM-T-easy-NRAMPl，pSP-EGFP分別用SacII和BamHI雙酶切，回收NRAMPl基因片段和載體，用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用I^stI酶切篩選陽(yáng)性克??；得表達(dá)載體pSP-NRAMPl-EGFP；將pSP-NRAMPl-EGFP用BamHI和NotI雙酶切并用Klenow補(bǔ)平，膠回收除去EGFP的載體并用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用B10I和HpaI雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，得pSP-NRAMPl-HA載體；2.3)pSP-NRAMPl-HA載體的驗(yàn)證小鼠巨噬細(xì)胞7用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37°C的C02孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。將巨噬細(xì)胞接種于M孔板，24h后更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)準(zhǔn)備用脂質(zhì)體-2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA，轉(zhuǎn)染4后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定IOmin；用10%山羊血清封閉15min，0.2%TritonX-IOO處理^iiin后用鼠源HA單抗4°C孵育過(guò)夜；用TRITC標(biāo)記的抗鼠的二抗室溫孵育lh，PBS洗5minX2次，用Hochest33342染核lmin，然后用熒光顯微鏡觀察NRAMPl的表達(dá)。一種利用pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染犢牛耳朵成纖維細(xì)胞構(gòu)建核移植供體細(xì)胞的方法，其特殊之處在于，該方法包括1)牛耳朵成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)1.1)在37°C解凍一管第四代秦川牛犢牛耳朵成纖維細(xì)胞，離心；1.2)棄去培養(yǎng)液，加入Iml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，所述培養(yǎng)液為含10%FBS的高糖DMEM；轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)液60mm培養(yǎng)皿，在(X)2孵箱中37°C培養(yǎng)；1.3)待牛成纖維細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入^iilPBS洗滌細(xì)胞，所述PBS無(wú)Ca2+Mg2+,棄去PBS加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞，待大多數(shù)細(xì)胞變圓、飄起時(shí)，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，使用移液器吹打混勻轉(zhuǎn)移到離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘后，棄去培養(yǎng)液并懸浮，按照13的比例傳代，置于CO2孵箱中37°C培養(yǎng)；1.4)取5-8代的牛成纖維細(xì)胞并G418藥物篩選作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；2)pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞2.1)轉(zhuǎn)染前1天，將牛成纖維細(xì)胞接種至60mm培養(yǎng)皿；培養(yǎng)液為含10%FBS、不含青霉素、鏈霉素的高糖DMEM；2.2)當(dāng)細(xì)胞匯片達(dá)到全皿的10%-15%時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)陳述的方法將重組質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞，以pEGFP-Nl載體作為陽(yáng)性對(duì)照；2.3)在轉(zhuǎn)染前l(fā)h，將培養(yǎng)液換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM；將6μgDNA和15μL脂質(zhì)體分別用500μL0pti-MEMEIReducedSerumMedium進(jìn)行稀釋，室溫孵育5min，將二者混合，再在室溫下孵育20min；2.4)最后將DNA/脂質(zhì)體混合物逐滴加至培養(yǎng)孔內(nèi)，在5%C02和飽和濕度下37°C培養(yǎng)；2.5)轉(zhuǎn)染Mi后換為含10%FBS的高糖DMEM；轉(zhuǎn)染24h后，更換含有終濃度為800μg/mLG418的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行篩選；同時(shí)，以未轉(zhuǎn)染的牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照；2.6)每隔3-4天換液，篩選2-3周，直至長(zhǎng)出陽(yáng)性細(xì)胞克隆，在皿底標(biāo)記克隆位置；2.7)挑取克隆并逐個(gè)將陽(yáng)性克隆傳至M孔培養(yǎng)板，一個(gè)孔接一個(gè)克??；培養(yǎng)液中G418含量減半；待細(xì)胞匯片達(dá)到7080%，胰酶消化后傳至六孔培養(yǎng)板；以同樣的方法，將六孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞傳至60mm培養(yǎng)皿擴(kuò)增；最后將60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化后凍存。3)pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞的鑒定3.1)擴(kuò)大培養(yǎng)pSP-NRAMPl-HA陽(yáng)性牛成纖維細(xì)胞，提取基因組DNA，并以基因組為模板，PCR鑒定NRAMPl基因是否整合到牛成纖維細(xì)胞中；3.2)取未轉(zhuǎn)染的正常牛成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照，取質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA為陽(yáng)性對(duì)照；設(shè)計(jì)引物2FCATTGCTTCAGGGCCTGTTC；PCR擴(kuò)增引物對(duì)為2F和IR；3.3)PCR反應(yīng)條件是95°C，5min；95°C30sec；60°C30sec；72°CImin；36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin；4°C保存；3.4)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。上述以G418藥物篩選是1)以G418藥物篩選成纖維細(xì)胞，pSP-NRAMPl-HA載體上含有neo基因，整合有該載體并表達(dá)neo基因的成纖維細(xì)胞能夠在一定濃度的G418篩選時(shí)存活，未整合該載體的成纖維細(xì)胞在該濃度下死亡；需要篩選正常成纖維細(xì)胞的G418最小致死濃度；2)牛成纖維細(xì)胞G418最小致死濃度的測(cè)定將牛成纖維細(xì)胞接種12孔板的12個(gè)孔，次日換液，每孔分別加入以終濃度100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100和1200μg/mLG418進(jìn)行培養(yǎng)，其間每隔3天換液一次，培養(yǎng)至2周；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的G418濃度等于或大于800μg/mL時(shí)，所有成纖維細(xì)胞都死亡，就G418對(duì)牛皮膚成纖維細(xì)胞的最小致死量是800μg/mL。一種以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSP-NRAMPl-HA載體的成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因克隆胚的制備方法，其特殊之處在于，該方法包括1)卵母細(xì)胞的收集及成熟培養(yǎng)1.1)收集牛卵巢，挑選2_8mm卵泡，獲取三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵丘細(xì)胞卵母細(xì)胞復(fù)合體；1.2)實(shí)體顯微鏡下將挑選的COCs用成熟液洗滌，用改良TCM-199成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)；在38.5°C,5%CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2122h；所述改良TCM-199成熟培養(yǎng)液組成TCM_199+10%單位為ν/ν的胎牛血清+2.5μg/mL丙酮酸鈉+10mM/LHEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mLITS+0.lIU/mLhMG+1μg/mLE2+10ng/mLEGF；1.3)卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后，將培養(yǎng)的COCs移入0.2%透明質(zhì)酸酶溶液中作用5min，用吸管反復(fù)吹打去除卵母細(xì)胞外周的顆粒細(xì)胞；1.4)選擇具有第一極體而且胞質(zhì)均一的卵母細(xì)胞用于核移植。2)核移植及重構(gòu)胚培養(yǎng)2.1)采用體細(xì)胞核移植技術(shù)將供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去除細(xì)胞核并成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞中；其中，供體細(xì)胞的代數(shù)應(yīng)控制在10代以內(nèi)以防止體外培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生突變；2.2)核移植過(guò)程將體外成熟培養(yǎng)212含有第一極體的MII期卵母細(xì)胞移入含有5mg/L細(xì)胞松弛素B的TCM-199+10%單位為ν/ν的FBS操作液微滴中，利用LEICA倒置顯微操作儀，在Spindle-View視野下吸取第1極體及其下方少量細(xì)胞質(zhì)；2.3)用0.25%的胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NRAMPl基因的成纖維細(xì)胞，懸浮在DMEM培養(yǎng)液中作為供核細(xì)胞；2.4)用注核管吸取大小適中，表面光滑的轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞，注入卵母細(xì)胞透明帶下；2.5)將注核卵母細(xì)胞在電融合液中應(yīng)用兩個(gè)直流電極給予一次性1.9KV/cm，和20μs電脈沖，使體細(xì)胞與卵母細(xì)胞質(zhì)融合；2.6)融合Ih后，檢查融合情況，將重組體在TCM-199+10%單位為ν/ν的胎牛血清+5μmol/L離子霉素中避光激活5min；隨后在TCM-199+10%單位為ν/ν的胎牛血清+2.5mmol/L6-DMAP的培養(yǎng)液中38.5°C、5%單位為ν/ν的C02、飽和濕度下培養(yǎng)46h；轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的有顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層的30μLG-I微滴中，4觀察分裂率，7將質(zhì)量較好的分裂激活胚胎轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的有顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層的30μLG-2微滴中，第79天觀察囊胚發(fā)育情況，整合有pSP-NRAMPl-HA載體的轉(zhuǎn)基因克隆胚構(gòu)建成功。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1、本發(fā)明構(gòu)建了一種NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，該載體含有巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP，能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因NRAMPl在牛的巨噬細(xì)胞中特異性的高效表達(dá)。2、本發(fā)明將NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到牛成纖維細(xì)胞中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的牛成纖維細(xì)胞系；經(jīng)過(guò)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，并通過(guò)PCR驗(yàn)證目的基因NRAMPl整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中。3、用整合目的基因NRAMPl的牛成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞通過(guò)核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚，將這些胚胎移入受體牛有望生產(chǎn)出轉(zhuǎn)NRAMPl基因的牛，該轉(zhuǎn)基因?？深A(yù)防牛布氏桿菌病的發(fā)生。圖1是EcoRI單酶切鑒定pGEM-T-easy-NRAMPl載體的結(jié)果圖；圖2是NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl_HA的載體圖譜；圖3是XhoI和HpaI雙酶切鑒定pSP-NRAMPl_HA載體的結(jié)果圖；圖4是pSP-NRAMPl-HA載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞7后免疫熒光圖；圖5是pSP-NRAMPl-HA載體轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞PCR鑒定的結(jié)果圖；圖6是包含pSP-NRAMPl-HA載體的轉(zhuǎn)基因克隆胚的孵化囊胚圖片。具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先構(gòu)建NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體ρSP-NRAMP1-HA，通過(guò)脂質(zhì)體法將外源表達(dá)載體pSP-NRAMPl-HA轉(zhuǎn)染入牛成纖維細(xì)胞。經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定證實(shí)目的基因NRAMPl整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中。將轉(zhuǎn)染NRAMPl的成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞移入牛去核卵母細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚。具體所涉及的試劑和材料如下G418,高糖DMEM，Trizol，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和Opti-MEfIReducedSerumMedium購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EDTA和Trypsin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿購(gòu)自Corning公司；TriplemasterSystem購(gòu)自Eppendorf;DNAmaker購(gòu)自天根公司；pGEM-TEasy載體和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；限制性核酸內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP、Klenow、和反轉(zhuǎn)錄試劑盒由!^rmentas公司提供；基因組提取試劑盒購(gòu)自Axygene；鼠源HA單克隆抗體購(gòu)自碧云天公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW^H.7購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室；秦川犢牛耳部皮膚成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。下面結(jié)合附圖和實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。1、巨噬細(xì)胞特異性載體pSP-NRAMPl-HA構(gòu)建1.1牛NRAMPl基因克隆在牛NRAMPl基因(Genebank序列號(hào)匪174652.2)的開(kāi)放閱讀框首尾兩端設(shè)計(jì)分別含有McII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物，正向引物IF:5，-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3‘(SacII)；反向引物IR5，-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3，(BamHI)。粗體為酶切位點(diǎn)SacII和BamHI，下劃線為Kozak序列，斜體為HA標(biāo)簽序列。引物有北京奧科公司合成。取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，采用Trizol方法提取脾臟組織中的總RNA，利用cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，用引物對(duì)IF和1R，用TriplemsastersystemPCR擴(kuò)增牛NRAMPl基因。反應(yīng)條件是95°C，5min;95°C30sec；66°C30sec；72°C2min；36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin；4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，與PGEM-Tfesy載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選重組子，對(duì)EcoRI酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為pGEM-T-easy-NRAMPl并用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。酶切鑒定的結(jié)果如圖1所示，泳道1是重組質(zhì)粒pGEM-T-easy-NRAMPl經(jīng)EcoRI酶切后產(chǎn)生1744bp特異性條帶，電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增出來(lái)的秦川黃牛NRAMPl的序列與Genebank中NM_174652.2通過(guò)Blast比對(duì)分析，有兩個(gè)堿基不同。第一個(gè)堿基是編碼區(qū)內(nèi)第145位A變?yōu)镚，導(dǎo)致第49位蘇氨酸(ACA)變?yōu)楸彼?GCA)。第二個(gè)堿基是157位A變?yōu)镃，但氨基酸性質(zhì)沒(méi)變都是精氨酸(AGG->CGG)。NRAMPl基因雖然較為保守，但在不同品種間存在多態(tài)性，造成這種突變可能是種屬間差異產(chǎn)生的一種多態(tài)現(xiàn)象。1.2牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性載體結(jié)構(gòu)及其構(gòu)建含有NRAMPl基因和巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(SP)以及抗性篩選基因(neo)的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)如圖2所示。SP是巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，這樣SP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的NRAMPl只在巨噬細(xì)胞中特異性表達(dá)。篩選基因(neo)用來(lái)篩選含有該載體的重組細(xì)胞，進(jìn)而為核移植提供供體細(xì)胞。1.2.1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP可以在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其中包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP(文陽(yáng)安，等。巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及靶向性研究。細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，M(5):441-443)0本發(fā)明以pSP-EGFP載體為骨架，通過(guò)插入目的基因NRAMPl并去掉EGFP構(gòu)建NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl-HA。1.2.2含NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl-HA的構(gòu)建將pGEM-T-easy-NRAMPl，pSP-EGFP分別用SacII和BamHI雙酶切，回收NRAMPl基因片段和載體，用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用I^stI酶切篩選陽(yáng)性克隆。進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)載體pSP-NRAMPl-EGFP。將ρSP-NRAMPI-EGFP用BamHI和NotI雙酶切并用Klenow補(bǔ)平，膠回收除去EGFP的載體并用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用XhoI和HpaI雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)而構(gòu)建pSP-NRAMPl_HA載體(如圖3)。1.2.3pSP-NRAMPl-HA載體的驗(yàn)證小鼠巨噬細(xì)胞7用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37°C的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。將巨噬細(xì)胞接種于M孔板，24h后更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)準(zhǔn)備用脂質(zhì)體-2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSP-NRAMPI-HA(具體方法按脂質(zhì)體-2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，轉(zhuǎn)染4后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定lOmin。用10%山羊血清封閉15min，0.2%TritonX-100處理aiiin后用鼠源HA單抗4°C孵育過(guò)夜。用TRITC標(biāo)記的抗鼠的二抗室溫孵育lh。PBS洗5minX2次。用Hochest33342染核lmin，然后用熒光顯微鏡觀察NRAMPl的表達(dá)。pSP-NRAMPl-HA載體轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，免疫熒光結(jié)果如圖4所示，該載體能在巨噬細(xì)胞中特異性表達(dá)。2.pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染犢牛耳朵成纖維細(xì)胞構(gòu)建核移植供體細(xì)胞2.1牛耳朵成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)在37°C解凍一管第四代秦川牛犢牛耳朵成纖維細(xì)胞，離心。棄去培養(yǎng)液，加入Iml培養(yǎng)液(含10%FBS的高糖DMEM)重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)液60m培養(yǎng)皿，在CO2孵箱中37°C培養(yǎng)。待牛成纖維細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入aiilPBS(無(wú)Ca2+Mg2+)洗滌細(xì)胞，棄去PBS，加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞，待大多數(shù)細(xì)胞變圓、飄起時(shí)，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，使用移液器吹打混勻轉(zhuǎn)移到離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘后，棄去培養(yǎng)液并懸浮，按照13的比例傳代，置于CO2孵箱中37°C培養(yǎng)。取5-8代的牛成纖維細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明以G418藥物篩選成纖維細(xì)胞，由于pSP-NRAMPl-HA載體上含有neo基因，因此整合有該載體并表達(dá)neo基因的成纖維細(xì)胞能夠在一定濃度的G418篩選時(shí)存活，而未整合該載體的成纖維細(xì)胞在該濃度下死亡。因此需要篩選正常成纖維細(xì)胞的G418最小致死濃度。牛成纖維細(xì)胞G418最小致死濃度的測(cè)定將牛皮膚成纖維細(xì)胞接種12孔板的12個(gè)孔，次日換液，每孔分別加入以終濃度100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100和1200yg/mLG418進(jìn)行培養(yǎng)，其間每隔3天換液一次，培養(yǎng)至2周。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的G418濃度等于或大于800μg/mL時(shí)，所有成纖維細(xì)胞都死亡，就G418對(duì)牛皮膚成纖維細(xì)胞的最小致死量是800μg/mL。2.2pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1天，將牛成纖維細(xì)胞接種至60mm培養(yǎng)皿。培養(yǎng)液為含10%FBS、不含青霉素、鏈霉素的高糖DMEM。當(dāng)細(xì)胞匯片達(dá)到全皿的10%-15%時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)陳述的方法將重組質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞，以pEGFP-Nl載體作為陽(yáng)性對(duì)照。在轉(zhuǎn)染前l(fā)h，將培養(yǎng)液換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM。將6μgDNA和15μL脂質(zhì)體分別用500μLOpti-MEfIReducedSerumMedium進(jìn)行稀釋，室溫孵育5min，將二者混合，再在室溫下孵育20min。最后將DNA/脂質(zhì)體混合物逐滴加至培養(yǎng)孔內(nèi)，在5%C02和飽和濕度下37°C培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染Mi后換為含10%FBS的高糖DMEM。轉(zhuǎn)染24h后，更換含有終濃度為800μg/mLG418的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行篩選；同時(shí)，以未轉(zhuǎn)染的牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照。每隔3-4天換液，篩選2-3周，直至長(zhǎng)出陽(yáng)性細(xì)胞克隆，用記號(hào)筆在皿底標(biāo)記克隆位置。挑取克隆并逐個(gè)將陽(yáng)性克隆傳至M孔培養(yǎng)板，一個(gè)孔接一個(gè)克隆。此后培養(yǎng)液中G418含量減半(400g/ml)。待細(xì)胞匯片達(dá)到7080%，胰酶消化后傳至六孔培養(yǎng)板。以同樣的方法，將六孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞傳至60mm培養(yǎng)皿擴(kuò)增。最后將60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化后凍存。本發(fā)明篩選的陽(yáng)性細(xì)胞都是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSP-NRAMPl-HA載體的成纖維細(xì)胞。載體整合到細(xì)胞的基因組上，隨著細(xì)胞DNA的復(fù)制而復(fù)制。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，pSP-NRAMPl-HA載體攜帶的SP啟動(dòng)子，NRAMPl基因和neo基因等元件會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，通過(guò)G418篩選2周后達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的，表現(xiàn)為篩選的細(xì)胞呈G418抗性。以上通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選整合有pSP-NRAMPl-HA載體細(xì)胞，得到含有NRAMPl基因的秦川牛的牛皮膚成纖維細(xì)胞。2.3PSP-NRAMP1-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞的鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)pSP-NRAMPl-HA陽(yáng)性牛成纖維細(xì)胞，提取基因組DNA，并以基因組為模板，PCR鑒定NRAMPl基因是否整合到牛成纖維細(xì)胞中；取未轉(zhuǎn)染的正常牛成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照，取質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA為陽(yáng)性對(duì)照。設(shè)計(jì)引物2FCATTGCTTCAGGGCCTGTTC；PCR擴(kuò)增引物對(duì)為2F和IR0PCR反應(yīng)條件是95°C，5min；95°C30sec；60°C30sec；72°CImin；36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin;4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其中泳道1是陰性對(duì)照，泳道2-6為pSP-NRAMPl-HA轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞，泳道7為陽(yáng)性對(duì)照，泳道8為DNAmarker0結(jié)果表明，pSP-NRAMPl-HA載體整合到宿主細(xì)胞牛成纖維細(xì)胞的基因組中。3以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSP-NRAMPl-HA載體的成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因克隆胚的制備3.1卵母細(xì)胞的收集及成熟培養(yǎng)從西安市屠宰場(chǎng)收集牛卵巢，挑選2_8mm卵泡，獲取三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵丘細(xì)胞卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-OocyteComplexes，COCs)。實(shí)體顯微鏡下將挑選的COCs用成熟液洗滌，用改良TCM-199成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)。在38.5°C,5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2122h。改良TCM-199成熟培養(yǎng)液組成TCM-199+10%(ν/ν)胎牛血清+2.5μg/mL丙酮酸鈉+10mM/LHEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mLITS+0.lIU/mLhMG+1μg/mLE2+10ng/mLEGF。卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后，將培養(yǎng)的COCs移入0.2%透明質(zhì)酸酶溶液中作用5min，用吸管反復(fù)吹打去除卵母細(xì)胞外周的顆粒細(xì)胞。選擇具有第一極體而且胞質(zhì)均一的卵母細(xì)胞用于核移植。3.2核移植及重構(gòu)胚培養(yǎng)采用體細(xì)胞核移植技術(shù)將供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去除細(xì)胞核并成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞中。其中，供體細(xì)胞整合有目的基因是轉(zhuǎn)基因克隆胚的關(guān)鍵，同時(shí)，供體細(xì)胞的代數(shù)應(yīng)控制在10代以內(nèi)以防止體外培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生突變。核移植過(guò)程將體外成熟培養(yǎng)212含有第一極體的MII期卵母細(xì)胞移入含有5mg/L細(xì)胞松弛素B的TCM-199+10%(v/v)FBS操作液微滴中(上覆石蠟油)，利用LEICA倒置顯微操作儀，在Spindle-View視野下吸取第1極體及其下方少量細(xì)胞質(zhì)。用0.25%的胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NRAMPl基因的成纖維細(xì)胞，懸浮在DMEM培養(yǎng)液中作為供核細(xì)胞。用注核管吸取大小適中，表面光滑的轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞，注入卵母細(xì)胞透明帶下。將注核卵母細(xì)胞在電融合液中應(yīng)用兩個(gè)直流電極給予一次性1.9KV/cm，和20μs電脈沖，使體細(xì)胞與卵母細(xì)胞質(zhì)融合。融合Ih后，檢查融合情況，將重組體在TCM-199+10%(ν/ν)胎牛血清+5μπι01/1離子霉素中避光激活5min。隨后在TCM-199+10%(ν/ν)胎牛血清+2.5mmol/L6-DMAP的培養(yǎng)液中38.5°C>5%(v/v)C02、飽和濕度下培養(yǎng)46h。轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的有顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層的30μLG-I微滴中，4觀察分裂率，7將質(zhì)量較好的分裂激活胚胎轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的有顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層的30μLG-2微滴中，第79天觀察囊胚發(fā)育情況。如圖6所示，轉(zhuǎn)基因克隆胚發(fā)育至孵化囊胚，圖中6Α是用Hochest33342染核照片，圖6B是明場(chǎng)照片。整合有pSP-NRAMPl-HA載體的轉(zhuǎn)基因克隆胚構(gòu)建成功，為預(yù)防牛布氏桿菌病打下了基礎(chǔ)。權(quán)利要求1.一種整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于其包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP以及HA標(biāo)簽的目的基因NRAMPl。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于還包括抗性篩選基因neo基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體，其特征在于該載體通過(guò)用SacII和BamHI酶切將NRAMPl基因克隆到巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP載體上，然后用BamHI和NotI將EGFP切除掉而獲得。4.一種含有權(quán)利要求1所述載體的牛成纖維細(xì)胞，其特征在于其宿主細(xì)胞是秦川牛耳朵皮膚成纖維細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將目的基因NRAMPl整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述牛成纖維細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是5-8代的秦川牛耳朵皮膚成纖維細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述牛成纖維細(xì)胞，其特征在于該牛成纖維細(xì)胞作為核移植共體細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚。7.一種整合牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括1)牛NRAMPl基因克隆1.1)在牛NRAMPl基因的開(kāi)放閱讀框首尾兩端設(shè)計(jì)分別含有SacII和BamHI酶切位點(diǎn)的引物，正向引物IF:5，-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3，；反向引物IR5’-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3’1.2)取成體秦川黃牛脾臟中約IOmg組織，采用Trizol方法提取脾臟組織中的總RNA，利用cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；1.3)以cDNA為模板，用引物對(duì)IF和1R，用TriplemsastersystemPCR擴(kuò)增牛NRAMPl基因；反應(yīng)條件是95°C，5min；95°C30sec；66°C30sec；72°C2min；36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin；4°C保存；1.4)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，與pGEM-TEasy載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑選重組子，對(duì)EcoRI酶切鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為pGEM-T-easy-NRAMPl并用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析；2)牛NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性載體構(gòu)建2.1)巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-EGFP可以在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，其中包含巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子SP;以pSP-EGFP載體為骨架，通過(guò)插入目的基因NRAMPl并去掉EGFP構(gòu)建NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl-HA；2.2)含NRAMPl巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMPl-HA的構(gòu)建將pGEM-T-easy-NRAMPl，pSP-EGFP分別用SacII和BamHI雙酶切，回收NRAMPl基因片段和載體，用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5ci，用I^stI酶切篩選陽(yáng)性克??；得表達(dá)載體pSP-NRAMPl-EGFP；將pSP-NRAMPl-EGFP用BamHI和NotI雙酶切并用Klenow補(bǔ)平，膠回收除去EGFP的載體并用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α，用B10I和HpaI雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，得pSP-NRAMPl-HA載體；.2.3)pSP-NRAMPl-HA載體的驗(yàn)證小鼠巨噬細(xì)胞7用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37°C的(X)2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。將巨噬細(xì)胞接種于M孔板，24h后更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)準(zhǔn)備用脂質(zhì)體-2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA，轉(zhuǎn)染4后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定IOmin；用10%山羊血清封閉15min，0.2%TritonX-IOO處理^iiin后用鼠源HA單抗4°C孵育過(guò)夜；用TRITC標(biāo)記的抗鼠的二抗室溫孵育lh，PBS洗5minX2次，用Hochest33342染核lmin，然后用熒光顯微鏡觀察NRAMPl的表達(dá)。8.一種利用pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染犢牛耳朵成纖維細(xì)胞構(gòu)建核移植供體細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括.1)牛耳朵成纖維細(xì)胞的培養(yǎng).1.1)在37°C解凍一管第四代秦川牛犢牛耳朵成纖維細(xì)胞，離心；.1.2)棄去培養(yǎng)液，加入Iml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，所述培養(yǎng)液為含10%FBS的高糖DMEM；轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)液60mm培養(yǎng)皿，在(X)2孵箱中37°C培養(yǎng)；.1.3)待牛成纖維細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入aiilPBS洗滌細(xì)胞，所述PBS無(wú)Ca2+Mg2+,棄去PBS加入0.25%的胰酶消化細(xì)胞，待大多數(shù)細(xì)胞變圓、飄起時(shí)，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，使用移液器吹打混勻轉(zhuǎn)移到離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘后，棄去培養(yǎng)液并懸浮，按照13的比例傳代，置于(X)2孵箱中37°C培養(yǎng)；.1.4)取5-8代的牛成纖維細(xì)胞并G418藥物篩選作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；.2)pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞.2.1)轉(zhuǎn)染前1天，將牛成纖維細(xì)胞接種至60mm培養(yǎng)皿；培養(yǎng)液為含10%FBS、不含青霉素、鏈霉素的高糖DMEM；.2.2)當(dāng)細(xì)胞匯片達(dá)到全皿的10%-15%時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)陳述的方法將重組質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞，以pEGFP-Nl載體作為陽(yáng)性對(duì)照；.2.3)在轉(zhuǎn)染前l(fā)h，將培養(yǎng)液換為無(wú)血清、無(wú)雙抗的DMEM；將6μgDNA和15μL脂質(zhì)體分別用500μL0pti-MEMEIReducedSerumMedium進(jìn)行稀釋，室溫孵育5min，將二者混合，再在室溫下孵育20min；.2.4)最后將DNA/脂質(zhì)體混合物逐滴加至培養(yǎng)孔內(nèi)，在5%C02和飽和濕度下37°C培養(yǎng)；.2.5)轉(zhuǎn)染他后換為含10%FBS的高糖DMEM；轉(zhuǎn)染24h后，更換含有終濃度為800μg/mLG418的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行篩選；同時(shí)，以未轉(zhuǎn)染的牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照；.2.6)每隔3-4天換液，篩選2-3周，直至長(zhǎng)出陽(yáng)性細(xì)胞克隆，在皿底標(biāo)記克隆位置；.2.7)挑取克隆并逐個(gè)將陽(yáng)性克隆傳至M孔培養(yǎng)板，一個(gè)孔接一個(gè)克?。慌囵B(yǎng)液中G418含量減半；待細(xì)胞匯片達(dá)到7080%，胰酶消化后傳至六孔培養(yǎng)板；以同樣的方法，將六孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞傳至60mm培養(yǎng)皿擴(kuò)增；最后將60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化后凍存。.3)pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞的鑒定.3.1)擴(kuò)大培養(yǎng)pSP-NRAMPl-HA陽(yáng)性牛成纖維細(xì)胞，提取基因組DNA，并以基因組為模板，PCR鑒定NRAMPl基因是否整合到牛成纖維細(xì)胞中；.3.2)取未轉(zhuǎn)染的正常牛成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照，取質(zhì)粒pSP-NRAMPl-HA為陽(yáng)性對(duì)照；設(shè)計(jì)引物2FCATTGCTTCAGGGCCTGTTC；PCR擴(kuò)增引物對(duì)為2F和IR；.3.3)卩0反應(yīng)條件是95°〇，511^11；95°C30sec；60°C30sec；72°CImin；36個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin；4°C保存；.3.4)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。9.根據(jù)權(quán)利要求8利用pSP-NRAMPl-HA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染犢牛耳朵成纖維細(xì)胞構(gòu)建核移植供體細(xì)胞的方法，其特征在于，所述以G418藥物篩選是.1)以G418藥物篩選成纖維細(xì)胞，pSP-NRAMPl-HA載體上含有neo基因，整合有該載體并表達(dá)neo基因的成纖維細(xì)胞能夠在一定濃度的G418篩選時(shí)存活，未整合該載體的成纖維細(xì)胞在該濃度下死亡；需要篩選正常成纖維細(xì)胞的G418最小致死濃度；.2)牛成纖維細(xì)胞G418最小致死濃度的測(cè)定將牛成纖維細(xì)胞接種12孔板的12個(gè)孔，次日換液，每孔分別加入以終濃度100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100和1200μg/mLG418進(jìn)行培養(yǎng)，其間每隔3天換液一次，培養(yǎng)至2周；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的G418濃度等于或大于800μg/mL時(shí)，所有成纖維細(xì)胞都死亡，就G418對(duì)牛皮膚成纖維細(xì)胞的最小致死量是800μg/mL。10.一種以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSP-NRAMPl-HA載體的成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因克隆胚的制備方法，其特征在于，該方法包括.1)卵母細(xì)胞的收集及成熟培養(yǎng).1.1)收集牛卵巢，挑選2-8mm卵泡，獲取三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵丘細(xì)胞卵母細(xì)胞復(fù)合體；.1.2)實(shí)體顯微鏡下將挑選的COCs用成熟液洗滌，用改良TCM-199成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)；在38.5°C,5%CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2122h；所述改良TCM-199成熟培養(yǎng)液組成TCM-199+10%單位為ν/ν的胎牛血清+2.5μg/mL丙酮酸鈉+10mM/LHEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mLITS+0.lIU/mLhMG+1μg/mLE2+10ng/mLEGF；.1.3)卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后，將培養(yǎng)的COCs移入0.2%透明質(zhì)酸酶溶液中作用5min，用吸管反復(fù)吹打去除卵母細(xì)胞外周的顆粒細(xì)胞；.1.4)選擇具有第一極體而且胞質(zhì)均一的卵母細(xì)胞用于核移植。.2)核移植及重構(gòu)胚培養(yǎng).2.1)采用體細(xì)胞核移植技術(shù)將供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去除細(xì)胞核并成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞中；其中，供體細(xì)胞的代數(shù)應(yīng)控制在10代以內(nèi)以防止體外培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生突變；.2.2)核移植過(guò)程將體外成熟培養(yǎng)212含有第一極體的MII期卵母細(xì)胞移入含有5mg/L細(xì)胞松弛素B的TCM-199+10%單位為ν/ν的FBS操作液微滴中，利用LEICA倒置顯微操作儀，在Spindle-View視野下吸取第1極體及其下方少量細(xì)胞質(zhì)；.2.3)用0.25%的胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NRAMPl基因的成纖維細(xì)胞，懸浮在DMEM培養(yǎng)液中作為供核細(xì)胞；.2.4)用注核管吸取大小適中，表面光滑的轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞，注入卵母細(xì)胞透明帶下；.2.5)將注核卵母細(xì)胞在電融合液中應(yīng)用兩個(gè)直流電極給予一次性1.9KV/cm，和20μs電脈沖，使體細(xì)胞與卵母細(xì)胞質(zhì)融合；·2.6)融合Ih后，檢查融合情況，將重組體在TCM-199+10%單位為ν/ν的胎牛血清+5μmol/L離子霉素中避光激活5min；隨后在TCM-199+10%單位為ν/ν的胎牛血清+2.5mmol/L6一DMAP的培養(yǎng)液中38.5°C、5%單位為ν/ν的C02、飽和濕度下培養(yǎng)46h；轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的有顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層的30μLG-I微滴中，4觀察分裂率，7將質(zhì)量較好的分裂激活胚胎轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備的有顆粒細(xì)胞飼養(yǎng)層的30μLG-2微滴中，第79天觀察囊胚發(fā)育情況，整合有PSP-NRAMP1-HA載體的轉(zhuǎn)基因克隆胚構(gòu)建成功。全文摘要一種整合牛NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體/牛成纖維細(xì)胞及其方法，構(gòu)建了一種包含NRAMP1巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)載體pSP-NRAMP1-HA，以及一種基于該載體的包含NRAMP1基因的秦川牛成纖維細(xì)胞系，利用該細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞的方法，為解決秦川牛布氏桿菌病的轉(zhuǎn)基因牛提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將外源性表達(dá)載體pSP-NRAMP1-HA導(dǎo)入牛成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定，證實(shí)目的基因NRAMP1整合到牛成纖維細(xì)胞的基因組中；最后將整合有NRAMP1基因的牛成纖維細(xì)胞作為核供體移入牛去核卵母細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚。文檔編號(hào)C12N15/85GK102559749SQ20101060353公開(kāi)日2012年7月11日申請(qǐng)日期2010年12月17日優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日發(fā)明者孟書(shū)燕,來(lái)威鋒,王華巖,程祥,鄧捷,馬曉玲申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)