專利名稱：具有抗癌及抑制巨噬細(xì)胞釋放no活性的新的二苯芐類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從蘭科石豆蘭屬植物密花石豆蘭Bulbophyllum odoratissimum Lindl.中提取分離的6個新的二苯芐類化合物(結(jié)構(gòu)如下)。這些化合物在體外實驗中對腫瘤細(xì)胞示有一定的抑制活性，對巨噬細(xì)胞釋放NO也有明顯的抑制活性，提示可能用于防治腫瘤以及防治因NO在體內(nèi)過度釋放誘發(fā)的種種疾病。
背景技術(shù)生物體中NO由NO合成酶(NOS)調(diào)控產(chǎn)生。目前為止已經(jīng)確定了三種同工酶神經(jīng)型NOS(又叫nNOS)，血管內(nèi)皮型NOS(eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。通常狀態(tài)下，人體中nNOS和eNOS都在正常生理條件下通過調(diào)控NO的釋放起到正常的生理作用。iNOS的表達(dá)與疾病，尤其是炎癥和癌癥有著密切的關(guān)聯(lián)。由iNOS誘發(fā)的NO過多的釋放，會非選擇性地對細(xì)胞組織造成損傷，引發(fā)各種疾病。NO釋放抑制劑可用于治療細(xì)胞中由病理濃度的NO誘發(fā)或加重的各種疾病[1]。
蘭科石豆蘭屬植物密花石豆蘭Bulbophyllum odoratissimum Lindl.主要分布于中國南方各省，到目前為止，盡管有從蘭科植物中分離得到二苯芐類化合物的報道，但是含有亞甲二氧基的二苯芐類化合物的報道就很少，更未見到有關(guān)該類化合物對巨噬細(xì)胞釋放NO有抑制活性的報道。本發(fā)明涉及的化合物(1)2-羥基-5-甲氧基-3，4，3’，4’-二亞甲二氧基二芐(2-hydroxy-5-methoxy-3，4，3’，4’-dimethylenedioxybibenzyl)、(2)2，3’-二羥基-5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基二芐(2，3’-dihydroxy-5-methoxy-3，4-methylenedioxybibenzyl)、(3)3’-羥基-5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基二芐(3’-hydroxy-5-methoxyl-3，4-methylenedioxybibenzyl)、(4)2，4’-二羥基-3’，5-二甲氧基-3，4亞甲二氧基二芐(2，4’-dihydroxy-3’，5-dimethoxy-3，4-methylenedioxybibenzyl)、(5)2，2’-二羥基-3，3’-二甲氧基-4，5-亞甲二氧基二芐(2，2’-dihydroxy-3，3’-dimethoxyl-4，5-methylenedioxybibenzyl)、(6)3’-羥基-3，5’-二甲氧基-4，5-亞甲二氧基二芐(3’-hydroxy-3，5’-dimethoxyl-4，5-methylenedioxybibenzyl)均為新化合物。
參考文獻[1]谷口直之、鈴木敬一朗，NOの生理作用と疾患，羊土社，2000。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新的二苯芐類化合物。本發(fā)明還涉及這些新的二苯芐類化合物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性以及對巨噬細(xì)胞釋放NO的抑制活性，以及它們在防治腫瘤及防治因體內(nèi)NO過度釋放誘發(fā)的神經(jīng)性疾病，炎性疾病，自體免疫性疾病，心血管疾病等中的應(yīng)用。
所述疾病可以是腦缺血、缺氧和其他與炎癥相關(guān)的神經(jīng)性疾病。如多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、帕金森氏病、癲癇、精神分裂癥，或者因心血管系統(tǒng)疾病以及自身免疫和/或炎癥引起的疾病，如高血壓，膿毒癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，胰島素依賴性糖尿病，骨盆/腸的炎性疾病，軟膜蛛網(wǎng)膜炎，腎小球性腎炎，急性和慢性肝病，或炎性皮膚病如牛皮癬等。
具體實施方案實施例1新的二苯芐類類化合物的分離方法本發(fā)明所用原料為蘭科石豆蘭屬植物密花石豆蘭Bulbophyllum odoratissimum Lindl的新鮮全草，采自中國廣西省。新鮮采集的原料室溫干燥，粉碎，用10倍量的10％-100％乙醇回流提取2次，合并提取液，減壓回收至干。該提取物用水分散后，用乙酸乙酯等劑量萃取3次，回收溶劑至干。將乙酸乙酯提取物進行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為洗脫劑，分別收集氯仿-甲醇50∶1，20∶1的洗脫流分。50∶1的洗脫流分再經(jīng)中低壓硅膠柱層析，環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，環(huán)乙烷-乙酸乙酯20∶1的洗脫流分析出一個結(jié)晶，為化合物1。10∶1的洗脫流分用反相ODS填料開放柱進行層析分離，甲醇-水梯度洗脫。60％甲醇洗脫部分再經(jīng)高效液相分離(泵SHIMADZU LC-8A；檢測器SPD-10Avp UV 280nm；色譜柱C-18，250×20mm，SHIMADZU Pakl；流動相55％甲醇-水)得到化合物2，3，4，5，6。
化合物12-羥基-5-甲氧基-3，4，3’，4’-二亞甲二氧基二芐(2-hydroxy-5-methoxy-3，4，3’，4’-dimethylenedioxybibenzyl)無色針狀結(jié)晶(環(huán)己烷-乙酸乙酯)，mp.140℃。FAB-MS(positive)給出分子離子峰316[M]+，HR FAB-MS(m/z)316.0966(calcd.，316.0947)確定分子式為C17H16O6。UV吸收λmaxnm(CH3OH)203.3，270.6及286.7(logε4.43，3.11 and 3.40)，顯示苯的典型特征吸收。IR(νmaxKBrcm-1)1489也證明結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。采用核磁共振儀(400MHz)測定了該化合物的1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，確定了該化合物的碳原子和氫原子歸屬。
詳見表1和表2。
化合物22，3’-二羥基-5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基二芐(2，3’-dihydroxy-5-methoxy-3，4-methylenedioxybibenzyl)白色蠟狀固體，mp.120.5～121℃。正離子ESI-MS譜給出(m/z)289[M+H]+，提示分子量為288。結(jié)合1H-NMR、13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C16H16O5。紫外λmaxnm(CH3OH)202.4，275.8及280.8(logε4.37，3.21及3.21)，顯示了苯的特征吸收。IRνmaxKBrcm-11597，1520也證明結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。采用核磁共振儀(400MHz)測定了該化合物的1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，確定了該化合物的碳原子和氫原子歸屬。
詳見表3和表4。
化合物33’-羥基-5-甲氧基-3，4-亞甲二氧基二芐(3’-hydroxy-5-methoxyl-3，4-methylenedioxybibenzyl)無色油狀。FAB-MS(positive)給出分子離子峰272[M]+，HR FAB-MS(m/z 272.1054，calcd.，272.1049)確定分子式為C16H16O4。UVλmaxnm(CH3OH)202.4，209.1及275.3(logε4.42，4.39 and 3.30)顯示了苯的特征吸收。IRνmaxKBrcm-11632，1589也證明結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。采用核磁共振儀(400MHz)測定了該化合物的1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，確定了該化合物的碳原子和氫原子歸屬。詳見表1和表2。
化合物42，4’-二羥基-3’，5-二甲氧基-3，4亞甲二氧基二芐(2，4’-dihydroxy-3’，5-dimethoxy-3，4-methylenedioxybibenzyl)白色粉末。FAB-MS(positive)給出(m/z)319[M+H]+，341[M+Na]+，357[M+K]+，ESI-MS(negative)給出(m/z)317[M-H]-，以上結(jié)果均提示化合物的分子量為318，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C17H18O6。IRνmaxKBrcm-11612，1519提示結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。采用核磁共振儀(400MHz)測定了該化合物的1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，確定了該化合物的碳原子和氫原子歸屬。詳見表3和表4。
化合物52，2’-二羥基-3，3’-二甲氧基-4，5-亞甲二氧基二芐(2，2’-dihydroxy-3，3’-dimethoxyl-4，5-methylenedioxybibenzyl)白色針晶(氯仿-甲醇)，mp.136-138℃。ESI-MS(positive)給出m/z341[M+Na]+和319[M+H]+。ESI-MS(negative)給出m/z317[M-H]-。通過ESI-MS圖譜的綜合分析，可以確定該化合物的分子量為318。HR FAB-MS(m/z 318.1101，calcd.，318.1103)確定分子式為C17H18O6。UVνmaxKBrnm(CH3OH)281.6及293.8(logε3.82 and 3.75)]顯示了苯的特征吸收。IRνmaxKBrcm-11620，1489也證明結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。采用核磁共振儀(400MHz)測定了該化合物的1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，確定了該化合物的碳原子和氫原子歸屬。詳見表1和表2。
化合物63’-羥基-3，5’-二甲氧基-4，5-亞甲二氧基二芐(3’-hydroxy-3，5’-dimethoxyl-4，5-methylenedioxybibenzyl)白色粉末，ESI-MS(positive)給出m/z325[M+Na]+和303[M+H]+。ESI-MS(negative)給出m/z301[M-H]-。通過ESI-MS圖譜的綜合分析，可以確定該化合物的分子量為302。HR FAB-MS(m/z 302.1150，calcd.，302.1154)給出分子式為C17H18O5。UV圖譜λmaxnm(CH3OH)272.6，280.4(logε3.44，3.44)，顯示了苯的典型特征。IRνmaxKBrcm-11620，1589，1508也證明結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)存在。采用核磁共振儀(400MHz)測定了該化合物的1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC等，確定了該化合物的碳原子和氫原子歸屬。詳見表1和表2。
表1 化合物1，3，5和6的13C-和1H-NMR數(shù)據(jù)(in CDCl3)*No.1 3 5 6CH C HC HC H1123.1s 136.2s 119.9s 144.2s2132.1s 102.4d 6.36d140.2s 107.7d 6.30m(2.2)3135.7s 148.7s 131.2s 143.3s4134.3s 133.3s 134.3s 133.3s5137.5s 143.5s 141.5s 148.7s6108.8d 6.20s 107.6d 6.27d103.0d6.37s102.5d 6.37d(2.2) (1.3)1’ 135.7s 143.3s 127.9s 136.2s2’ 109.0d 6.67d 115.4d 6.64m143.6d6.64m108.0 d 6.25d(1.6) (1.4)3’ 147.5s 155.5s 146.4s 156.6s4’ 145.7s 112.8d 6.64m108.6d6.74m99.1d 6.25d(1.4)5’ 108.1d 6.61dd129.5d 7.15t119.3d6.76m160.8s(7.8，1.6)(7.6)6’ 121.2d 6.71d 121.0d 6.74d122.4d6.76m106.7d 6.31m(7.8) (7.6)a36.4t2.78br.s 37.9t 2.81br.s 30.1t 2.85br.s 37.5t 2.77br.sa’ 32.4t2.78br.s 37.7t 2.81br.s 30.4t 2.85br.s 38.1t 2.77br.s-OCH357.1q3.79s 56.5q 3.85s59.9q 4.04s56.5q 3.85s-OCH356.0q 3.89s55.2q 3.74s-O-CH2-O- 101.8t 5.94s 101.2t 5.91s100.8t5.84s101.1t 5.91s-O-CH2-O- 100.7t 5.90s*δin ppm，J(in parentheses)in Hz
表2 化合物2和4的13C-和1H-NMR數(shù)據(jù)(in MeOD)*No. 2 4CH CH1124.1s 125.5s2133.0s 134.5s3136.2s 137.6s4134.5s 135.9s5136.8s 138.2s6109.3d 6.19s 110.9d 6.16s1’ 143.7s 135.2s2’ 115.0d 6.64m 113.4d 6.68d(1.8)3’ 156.8s 148.6s4’ 112.2d 6.60dd(7.6，2.0)145.5s5’ 128.8d 7.06t(7.6) 116.0d 6.67d(8.0)6’ 119.1d 6.67d(7.6) 122.0d 6.58dd(8.0，1.9)a32.0t2.78m 33.7t2.75ma’ 36.3t2.78m 37.2t2.75m-OCH356.4q3.72s 57.8q3.78s-OCH356.3q3.71s-O-CH2-O- 101.1t 5.87s 102.3t 5.86s*δin ppm，J(in parentheses)in Hz實施例2 體外抗癌活性測試選用肝癌HepG2細(xì)胞和Hela細(xì)胞為模型，以順鉑為陽性藥，利用MTT法測定了化合物體外抗腫瘤的活性，結(jié)果見下表3。
表3 化合物體外抗腫瘤活性結(jié)果化合物HepG2 IC50(μM) Hela IC50(μM)1 ＞100 49.22 ＞100 ＞1003 33＞1004 ＞100 ＞100
5 64 ＞1006 12 ＞100實施例3 體外抑制NO釋放的活性測試RAW264.7細(xì)胞(源于美國ATCC)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1.2×106/mL，以每孔200μL加入于96孔培養(yǎng)板中，5％CO2，37℃，培養(yǎng)2小時。加入LPS(10μg/mL)2μL，IFN-γ(33ng/mL)2μL，樣品DMSO溶液0.4μL，使LPS終濃度為100ng/mL，IFN-γ終濃度為100ng/mL，溶解樣品的DMSO相對于培養(yǎng)基的含量為0.2％。培養(yǎng)16小時。隨后取上清液100μL，加入事先調(diào)好的Griess試藥，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm(對照655nm)測定吸光度。陽性對照用的是quercetin，因為有文獻報道quercetin有較好的NO產(chǎn)生抑制活性，其抑制NO釋放的IC50是26.8μM。
用此方法測定化合物體外抑制NO釋放的活性，結(jié)果見表4。
表4 化合物體外抑制NO釋放的活性結(jié)果化合物 IC50(μM)1 4.82 15.23 13.24 22.65 22.66 22.權(quán)利要求
1.具有下列結(jié)構(gòu)的新的二苯芐類化合物。
2.權(quán)利要求1所述的新的二苯芐類化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，以及作為癌癥防治藥物的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的新的二苯芐類化合物對巨噬細(xì)胞釋放NO活性的抑制作用，以及它們用于因NO過度釋放誘發(fā)的種種疾病的治療藥物。
4.權(quán)利要求1所述新的二苯芐類化合物組成的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抑制腫瘤細(xì)胞活性及抑制巨噬細(xì)胞釋放NO活性的新的二苯芐類化合物。本發(fā)明從蘭科石豆蘭屬植物密花石豆蘭Bulbophyllum odoratissimum Lindl.中分離得到6個新的二苯芐類化合物。這些化合物在體外可以顯著抑制巨噬細(xì)胞中NO的釋放，同時對一些腫瘤細(xì)胞也有一定的抑制作用。本發(fā)明涉及的這些化合物可考慮用于防治腫瘤以及因NO在體內(nèi)過度釋放誘發(fā)的種種疾病。
文檔編號A61P35/00GK1594309SQ200410027819
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月29日
發(fā)明者姚新生, 王乃利, 北中進, 劉岱琳, 張家欣 申請人:深圳中藥及天然藥物研究中心