一種合成用青霉素g?；竿蛔凅w及其在制備阿莫西林中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及酶工程領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及一種合成用青霉素G?；竿?變體以及該突變體固定化酶在制備阿莫西林生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿莫西林（Amoxicillin)，是一種最常用的青霉素類(lèi)廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。目 前，工業(yè)上生產(chǎn)阿莫西林的方法有化學(xué)合成法和酶法兩種方法，酶法具有成本較低、工藝簡(jiǎn) 單、綠色無(wú)污染及反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此，日益受到重視。
[0003] 青霉素G?；福╬enicillinGacylase，PGA，EC3. 5. 1. 11)，在酸性條件下催化 母核出-APA或者7-ADCA)和側(cè)鏈合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（如：阿莫西林、氨芐西林、頭 孢氨芐和頭孢羥氨芐等）；在堿性條件下水解青霉素G制備6-ΑΡΑ或水解頭孢菌素G制備 7-ADCA。
[0004] 野生型的青霉素G酰化酶的來(lái)源十分廣泛，目前，已經(jīng)篩選出眾多產(chǎn)青霉素G?；?酶的微生物并將其編碼基因克隆出來(lái)，如大腸埃希氏菌（EscherichiacoliATCC11105)、 黃桿菌（Flavobacteriumsp. 650)、巨大芽抱桿菌（Bacillusmegaterium)、奠產(chǎn)喊桿菌 (Alcaligenesfaecalis)、木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacterxylosoxidans)、無(wú)色桿菌 屬（Achromobactersp.CCM4824)、嗜朽1 檬酸克呂沃爾氏菌（Kluyveracitrophila)、雷氏 普羅威登斯菌（Providenciarettgeri)等。
[0005] 目前，在酶法生產(chǎn)阿莫西林的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，野生型青霉素G?；杆饣钚愿摺⒑?成活性低、合成水解比（S/Η)小、側(cè)鏈消耗高、尤其是酶的耐酸性弱、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，導(dǎo)致 酶法制備阿莫西林的成本較高。
[0006] 隨著基因工程和蛋白工程技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外科研工作者運(yùn)用理性設(shè)計(jì)、半理性 設(shè)計(jì)以及非理性設(shè)計(jì)等手段對(duì)青霉素G?；傅暮铣尚阅苓M(jìn)行突變改造的報(bào)道有很多，如 中國(guó)專(zhuān)利CN101177688中，黃鶴、張磐等運(yùn)用同源建模及定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)巨大芽孢桿菌PGA 的α144位點(diǎn)上的酪氨酸突變?yōu)榫彼嵋约唉?4位點(diǎn)的纈氨酸突變?yōu)楸奖彼?，獲得突變 體酶的合成性能、S/Η比以及7-ADCA轉(zhuǎn)化率都有很大的提高；中國(guó)專(zhuān)利CN103275960中， 賴紅星，肖擁軍等對(duì)無(wú)色桿菌青霉素G酰化酶酶原進(jìn)行人工設(shè)計(jì)并表達(dá)，獲得了一種可以 合成阿莫西林的PGA，其酶活力達(dá)到了 28000U/L(組成型）或35000U/L(誘導(dǎo)型）；程天凡 (浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005)對(duì)5種野生型PGA基因進(jìn)行DNA家族混組同時(shí)結(jié)合抑菌圈 篩選技術(shù)，獲得了合成性能和S/Η值都顯著提高的PGA突變體；SenwenDeng，ErZhengSu等 (JournalofBiotechnology,Volume199,lOApril2015,Pages62 - 68)利用蛋白改造技 術(shù)對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌PGA進(jìn)行改造，將其β24位點(diǎn)上的苯丙氨酸突變?yōu)楦拾彼?、丙氨酸、絲氨酸 或脯氨酸，其中Fβ24G合成氨芐西林的效果最好；國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W02010/072765報(bào)道了對(duì) 大腸桿菌ATCC11105 來(lái)源的PGA進(jìn)行改造，對(duì)其Α3、Α77、Α90、Α144、Α192、Β24、Β109、Β148、 Β313、Β460和Β488進(jìn)行單點(diǎn)或組合突變，得到合成性能和S/Η值大大提高的多個(gè)突變體； 歐洲專(zhuān)利EP0961825報(bào)道了運(yùn)用蛋白工程技術(shù)對(duì)大腸桿菌PGA的β24位點(diǎn)上的苯丙氨酸 突變?yōu)楸彼峄蛄涟彼?，其合成氨芐青霉素和頭孢氨芐的能力大大提升。
[0007] 雖然，國(guó)內(nèi)外利用基因工程及蛋白工程技術(shù)對(duì)青霉素G?；高M(jìn)行改造，使其合 成性能及合成活力有了很大的提高，但是，突變酶的耐酸性還很弱、合成活性還偏低、及固 定化酶的操作穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高。因此，開(kāi)發(fā)一種耐酸性強(qiáng)、合成活性高及操作穩(wěn)定性 好的酶具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種耐酸性強(qiáng)、水解活性低、合成活性高、S/Η值 高及操作穩(wěn)定性好青霉素G?；竿蛔凅w。其在木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacter xylosoxidans)野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上有如下六個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)點(diǎn)突變 或多點(diǎn)組合突變：α亞基上第162位氨基酸由Μ突變?yōu)長(zhǎng)、β亞基上第24位氨基酸由F突 變?yōu)镚、β亞基上第241位氨基酸由Ν突變?yōu)镼、β亞基上第71位氨基酸由F突變?yōu)棣?、?亞基上第64位氨基酸由Α突變?yōu)棣?、β亞基上?10位氨基酸由Α突變?yōu)閂;
[0009] 所述的木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacterxylosoxidans)野生型青霉素G酰化 酶氨基酸序列由232個(gè)氨基酸組成的α亞基、54個(gè)氨基酸組成的中間連接肽和557個(gè)氨基 酸組成的β亞基三部分構(gòu)成，序列如SEQIDNO. 1所示。
[0010] 所述的青霉素G酰化酶突變體逐步優(yōu)選的序列如下：
[0011] 1、是在SEQIDNO. 1的野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上有如下四個(gè)位點(diǎn) 中的一個(gè)點(diǎn)突變或多點(diǎn)組合突變：α亞基上第162位氨基酸由Μ突變?yōu)長(zhǎng)、β亞基上第24 位氨基酸由F突變?yōu)镚、β亞基上第241位氨基酸由Ν突變?yōu)镼、β亞基上第71位氨基酸 由F突變?yōu)棣础?br>[0012] 2、是在SEQIDNO. 1的野生型青霉素G?；赴被嵝蛄谢A(chǔ)上對(duì)β亞基上第 241位氨基酸由Ν突變?yōu)镼，即為SPGA-1突變體。
[0013] 3、是在SPGA-1的氨基酸序列基礎(chǔ)上有如下一個(gè)點(diǎn)突變或兩個(gè)點(diǎn)突變或三個(gè)點(diǎn)組 合突變：α亞基上第162位氨基酸由Μ突變?yōu)長(zhǎng)、β亞基上第24位氨基酸由F突變?yōu)镚、 β亞基上第71位氨基酸由F突變?yōu)棣?，其中?yōu)選在SPGA-1的氨基酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行三個(gè) 點(diǎn)組合突變，得到野生型青霉素G?；赴被嵝蛄械乃狞c(diǎn)組合突變體SPGA-2。
[0014] 4、是在SPGA-2的氨基酸序列基礎(chǔ)上對(duì)β亞基上第64位氨基酸由Α突變?yōu)棣?，?突變體即為SPGA-3A突變體?；蛘呤窃赟PGA-2的氨基酸序列基礎(chǔ)上對(duì)β亞基上第310位 氨基酸由Α突變?yōu)閂，該突變體即為SPGA-3B突變體。
[0015] 5、最優(yōu)選是在SPGA-2的氨基酸序列基礎(chǔ)上對(duì)β亞基上第64位氨基酸由A突變 為T(mén)，對(duì)β亞基上第310位氨基酸由A突變?yōu)閂得到野生型青霉素G?；赴被嵝蛄械?六點(diǎn)組合突變體，即為SPGA-4,序列如SEQIDN0:3所示。
[0016] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的青霉素G?；竿蛔凅w的核苷酸序列，為以下 的任一種：
[0017] 1)上述青霉素G?；竿蛔凅w中的任一種的核苷酸序列；
[0018] 2)在嚴(yán)格條件下與1)中任一項(xiàng)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有青霉素G酰化 酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
[0019] 3)與1)或2)中任一項(xiàng)限定的基因序列具有90%以上的同源性且編碼具有青霉 素G酰化酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0020] 本發(fā)明的突變型青霉素G?；傅闹苽浞椒?，包括以下步驟：
[0021] a)將具有序列表中SEQIDN0. 2的木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacter xylosoxidans)野生型青霉素G?；高M(jìn)行飽和突變、迭代飽和突變和隨機(jī)突變等步驟得 到編碼上述任一種青霉素G酰化酶的突變體的基因序列；
[0022] b)將突變體基因序列插入到質(zhì)粒中得到表達(dá)載體；
[0023] c)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株中得到重組基因工程菌；
[0024] d)將重組基因工程菌用乳糖誘導(dǎo)進(jìn)行發(fā)酵得到青霉素G?；浮?br>[0025] 本發(fā)明涉及的突變型青霉素G?；傅闹苽浞椒?，進(jìn)一步地，還包括純化步驟，純 化步驟為將產(chǎn)青霉素G酰化酶重組菌破碎、離心、收集后通過(guò)固定化金屬螯合親和層析法 進(jìn)行純化得到青霉素G?；讣兠浮?br>[0026] 進(jìn)一步地，還包括酶的固定化步驟，固定化步驟為將上述純化后的酶液，用磷酸鹽 緩沖液（pH8.0、0.lmol/L)溶解，然后加入50g經(jīng)活化處理后的載體，于25°C、120rpm條件 下低速攪拌固定化48h，將所得固定化酶用去離子水反復(fù)清洗3~5遍，真空濾干后即得固 定化酶終產(chǎn)品。
[0027] 進(jìn)一步地，固定化載體為環(huán)氧基載體ECEP或氨基載體ECHA/S。
[0028] 進(jìn)一步地，質(zhì)粒為pET28b(+)，菌株為E.coliBL21(DE3)。
[0029] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的青霉素G?；傅耐蛔凅w固定化酶在制備阿 莫西林中的應(yīng)用。
[0030] 所述的應(yīng)用具體為：以本發(fā)明的青霉素G?；竿蛔凅w固定化酶為催化劑，采用 10°C或20°C固體法催化合成阿莫西林，其中底物6-APA和D-HPM直接固體投料無(wú)需溶解，過(guò) 程反應(yīng)控制中，反應(yīng)pH無(wú)需控制，僅需控制反應(yīng)溫度10 °C或20 °C。
[0031] 本發(fā)明優(yōu)勢(shì)：
[0032] 本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)結(jié)合定點(diǎn)飽和突變技術(shù)的半理性設(shè)計(jì)及定向進(jìn)化的 酶工程改造技術(shù)對(duì)木糖氧化無(wú)色桿菌（Achromobacterxylosoxidans)來(lái)源的青霉素G?；?酶進(jìn)行突變，獲得了水解活力更低，合成活力更好，合成水解比值（S/