一種源于綠色巴夫藻的二磷酸核酮糖羧化酶大亞基新基因的制作方法
【專利說(shuō)明】一種源于綠色巴夫藻的二磷酸核酮糖羧化酶大亞基新基因
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本申請(qǐng)屬于基因克隆分離的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及于一種來(lái)源于微藻的有關(guān)1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因及其分離方法。
【背景技術(shù)】
[0003]1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶廣泛分布于自養(yǎng)生物中，是自養(yǎng)生物同化、還原碳元素的關(guān)鍵酶。1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶由大亞基(rbcL)和小亞基(rbcS)組成，其中rbcL在進(jìn)化上變化較慢，因此對(duì)rbcL編碼基因基因克隆和序列分析不僅有利于研究該種自養(yǎng)生物的合成代謝途徑，同時(shí)也是確定其分類(lèi)地位的重要手段。綠色巴夫藻{Pavlova viridis)是一類(lèi)化能自養(yǎng)型真核微藻，是一類(lèi)具有重要資源意義和研究?jī)r(jià)值的海洋藻類(lèi)。到目前為止，綠色巴夫藻的rbcL編碼基因尚屬未知，制約了其合成代謝的研究和分類(lèi)地位的確認(rèn)。為填補(bǔ)此空白，本申請(qǐng)?jiān)噲D從rbcL的基因克隆和序列分析的角度展開(kāi)相應(yīng)的工作。
[0004]RACE全稱rapid-amplificat1n of cDNA ends，是一種常用的通過(guò)PCR進(jìn)行 cDNA末端快速克隆的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用RACE技術(shù)來(lái)獲得目的mRNA片段的保守區(qū)側(cè)向序列乃至全長(zhǎng)序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]綠色巴夫藻ifEivlovEL viridis)為常用微藻，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院青島海洋研究所。
[0006]綠色巴夫藻rbcL基因的分離過(guò)程為:
(1)利用本領(lǐng)域常規(guī)的mRNA提取分離手段獲得綠色巴夫藻的總mRNA，并使用引物OligodT以本領(lǐng)域常規(guī)手段將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
(2)使用cDNA作為模板，根據(jù)rbcL同源基因的保守性設(shè)計(jì)引物PrF、PrR來(lái)進(jìn)行保守區(qū)基因的擴(kuò)增，其引物序列為:PrF:5’ -TGTAATTGTAGAGCGTGA-3’ ; PrR:5’-CACCTTCTAGCTTACCTACA-3’； PCR反應(yīng)條件為:94°C 3 min ；94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C1 min, 30個(gè)循環(huán)；72°C 10 min;所獲PCR產(chǎn)物大小約為540bp ;
(3)3’末端的擴(kuò)增反應(yīng)以cDNA為模板、使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒來(lái)進(jìn)行，使用的擴(kuò)增引物分別是:UPM (10 X universal primer mix) ; el orbGTATGTCAGGTGTTGACCACAT。梯度PCR反應(yīng)程序?yàn)?94oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min,5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲PCR產(chǎn)物大小約為560 bp.(4)5’末端的擴(kuò)增反應(yīng)使用總mRNA為模板并使用SMARTRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒來(lái)進(jìn)行，使用的引物分別為:UPM5’(lOXuniversal primer mix) ; GSP1 TTAACTGTAGCACCAAGAA;GSP2 CCGAACTTGTCCATACGCT。反應(yīng)程序?yàn)?加入 GSP1 于 mRNA 中后以 94oC 3 min; 94oC 30s, 6O0C 30s, 72oCl min反應(yīng)1個(gè)循環(huán)；隨后加入TdT于37oC反應(yīng)30min獲得特定末端產(chǎn)物；然后向體系中加入U(xiǎn)PM5’和GSP2，以如下程序完成反應(yīng):94oC 3 min; 94oC 30 s,72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC30 s，72oC 3 min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲目的片段約為620bp。
[0007]以上所有的片段均連入PMD18T載體后進(jìn)行測(cè)序后拼接。
[0008](5)開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增:在經(jīng)過(guò)拼接獲得了表達(dá)基因的全長(zhǎng)之后，分別設(shè)計(jì)上下游引物 ATGGATCCTGACTACGCTATCA 和 TCAAACGTTAGCTGTTGCTG，經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得完整的 rbcL開(kāi)放閱讀框片段。PCR反應(yīng)條件為:94oC 3 min ；94oC 30 s, 58oC 30 s, 72oC 1 min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min;片段大小為1365bp。
[0009]最終所得來(lái)自綠色巴夫藻的推定的1，5- 二磷酸核酮糖大亞基的全長(zhǎng)多核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。該基因所編碼的氨基酸序列與來(lái)自于Pavlova salina的rbcL的活性區(qū)域具有較高的序列相似性(95 %)(如圖1所示)，證實(shí)其為一種典型的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基的編碼基因。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析(如圖2所示)，進(jìn)一步確定了綠色巴夫藻的分類(lèi)地位。
[0010]本申請(qǐng)首次從綠色巴夫藻的基因組中分離獲得了 1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亞基的編碼基因，豐富了該類(lèi)酶的重要的基因資源，為進(jìn)一步研究該重要真核微藻的碳同化途徑以及確定其分類(lèi)地位奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1
SEQ ID N0.1與來(lái)自Pavlova salina的rbcL基因的比對(duì)結(jié)果圖2
SEQ ID N0.1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析
【具體實(shí)施方式】
[0012]綠色巴夫藻rbcL基因的分離過(guò)程為:
(1)利用本領(lǐng)域常規(guī)的mRNA提取分離手段獲得綠色巴夫藻的總mRNA，并使用引物OligodT以本領(lǐng)域常規(guī)手段將之反轉(zhuǎn)錄為cDNA;
(2)使用cDNA作為模板，根據(jù)rbcL同源基因的保守性設(shè)計(jì)引物PrF、PrR來(lái)進(jìn)行保守區(qū)基因的擴(kuò)增，其引物序列為:PrF:5’ -TGTAATTGTAGAGCGTGA-3’ ; PrR:5’-CACCTTCTAGCTTACCTACA-3’； PCR反應(yīng)條件為:94°C 3 min ；94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C1 min, 30個(gè)循環(huán)；72°C 10 min;所獲PCR產(chǎn)物大小約為540bp ;
(3)3’末端的擴(kuò)增反應(yīng)以cDNA為模板、使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒來(lái)進(jìn)行，使用的擴(kuò)增引物分別是:UPM (10Xuniversal primer mix) ; elo9_3GTATGTCAGGTGTTGACCACAT。梯度PCR反應(yīng)程序?yàn)?94oC 3 min; 94oC 30 s, 72oC 3 min,5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC 30 s，72oC 3min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲PCR產(chǎn)物大小約為560 bp.(4)5’末端的擴(kuò)增反應(yīng)使用總mRNA為模板并使用SMARTRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒來(lái)進(jìn)行，使用的引物分別為:UPM5’(lOXuniversal primer mix) ; GSP1 TTAACTGTAGCACCAAGAA;GSP2
CCGAACTTGTCCATACGCT。反應(yīng)程序?yàn)?加入 GSP1 于 mRNA 中后以 94oC 3 min; 94oC 30s, 6O0C 30s, 72oCl min反應(yīng)1個(gè)循環(huán)；隨后加入TdT于37oC反應(yīng)30min獲得特定末端產(chǎn)物；然后向體系中加入U(xiǎn)PM5’和GSP2，以如下程序完成反應(yīng):94oC 3 min; 94oC 30 s,72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s, 70oC 30 s, 72oC 3 min, 5 個(gè)循環(huán)；94oC 30 s，68oC30 s，72oC 3 min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min。所獲目的片段約為620bp。
[0013]以上所有的片段均連入PMD18T載體后進(jìn)行測(cè)序后拼接。
[0014](5)開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增:在經(jīng)過(guò)拼接獲得了表達(dá)基因的全長(zhǎng)之后，分別設(shè)計(jì)上下游引物 ATGGATCCTGACTACGCTATCA 和 TCAAACGTTAGCTGTTGCTG，經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得完整的 rbcL開(kāi)放閱讀框片段。PCR反應(yīng)條件為:94oC 3 min ；94oC 30 s, 58oC 30 s, 72oC 1 min, 30個(gè)循環(huán)；72oC 10 min;片段大小為1365bp。
[0015]
說(shuō)明書(shū)氨基酸和核苷酸序列表 SEQ ID N0.1:
P.Kirii/is的1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亞基的基因序列ATGGATCCTGACTACGCTATCAAAGAGACTGATGTTCTAGCAATGTTCCTTCTTACACCTCAACCAGGTGTAGACCCTGTAGAGTGTGCTGCAGAGGTTGCTGGGGCGTCTTCTACTGCTACTAGGACTGTAGTATGTACTGACCTACTTACTGCTTGTGACCTAGACCGTGCAAAAGCATTCCGTGTAGATCCAGTACCTAACTCTTCTGATCAGTACTTTGCTTACATCGCATACGATATCGACCTATTTGAGGAAGGCTCTCTTGCTAACCTTACTGCTTCGATCATTGGTAACGTTTTCGGATTCAAGGCTGTTAAAGCCTCGTCTAGAAGATATGCGTATTCCTTACACGCTTACTTAAAGACTTTCCAAGGTCCTGCTACTGGGTGTAATTGTAGAGCGTGAGCGTATGGACAAGTTCGGTCGTCCACTTCTTGGTGCTACAGTTAAGCCTAAGCTAGGTCTTTCTGGTAAGAACCGCGGACGTGTAGTATTCGAAGGTCTTAAAGGTGGTCTAGACTTCCTTAAGGATGATGAGAACATTAACTCACAACCATTCATGCGTAGGAGAGAGCGTTTCCTATTCTCTATGGAAGGTGTTAACCGTGCAGCTGCAGCTTCTGGAGAAGTTATTGGTCACTACCTAAACGCTACTGCTGGTACTATGGAAGAAACACGTGCAGATTACTCTAAGAGCCTTGGTTCGATCATTACAATGATTGACCTTGTTATCGGATACACAGCTATTCAAACTATGGCTATCTGGGCTCGTAAGACCTAGACGATATGATCCTTCACCTTCACCGTGCAGGTAGATCATCTTACTCTCGTCTGAATAACCACGGAAGGAACTTCCGTGTAATCTGTAAGTGGATGCGTATGTCAGGTGTTGACCACATTCACGCTGGTACTGTTGTAGGTAAGCTAGAAGGTGATCCTCTAATGGTTAAAGGATTCTACAACACTCTTCTTGAGAATCAGACTGACATCAACCTTCCAGAAGGTCTATTCTTCGAGCAAGATTGGGCGTCTCTACGTAAGTGTCTACCAGTAGCATCTGGTGGTATCCACTGTGGACAAATGCACCAACTTATCGAGTACCTAGGTGACGACGTTGTACTTCAGTTCGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCAGACGGAATCCAGGCTGGTGCGACTGCTAACCGTGTTGCTCTTGAGTGCATGGTGCTAGCTCGTAACGAAGGTCGTGATTACGTTGCTGAAGGTCCTCAAATCCTAAGAGACGCTGCTAAGTCTTGTGGTCCTCTACAAACAGCACTTGATCTTTGGAAAGATATTACATTCAACTACACTTCAACTGATACAGCAGCAACAGCTAACGTTTGA
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從微藻中克隆得到1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因的方法，其特征在于，首先分離得到微藻的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以之為模板，根據(jù)延伸酶基因保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物從而擴(kuò)增得到保守區(qū)基因；接下來(lái)分別對(duì)其5’末端和3’末端進(jìn)行末端擴(kuò)增獲得全基因序列后，通過(guò)普通PCR的方法獲得表達(dá)基因。2.—種來(lái)自于綠色巴夫藻的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因的開(kāi)放閱讀框序列，其特征在于，其序列如SEQ ID.N0.1所示。
【專利摘要】1,5-二磷酸核酮糖羧化酶是生物體進(jìn)行碳同化的關(guān)鍵酶，rbcL是該酶的大亞基。針對(duì)于能夠利用二氧化碳合成有機(jī)物的一種化能自養(yǎng)型微藻-綠色巴夫藻(<i>Pavlova</i><i>？viridis</i>)，本申請(qǐng)使用了保守區(qū)序列擴(kuò)增和RACE相結(jié)合的方法克隆獲得了一種新的rbcL基因。該基因的獲得既有利于認(rèn)識(shí)綠色巴夫藻的合成代謝，同時(shí)可助于準(zhǔn)確鑒定其分類(lèi)地位。
【IPC分類(lèi)】C12N15/60, C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105274091
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510825503
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】徐毅
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月24日