1離心3111；[11棄上清，沉 淀室溫晾干，最后加入40μ1水溶解，即可用于載體構(gòu)建或轉(zhuǎn)化使用。
[0045] 2.CMV啟動(dòng)子克隆
[0046] 以本實(shí)施例的前述步驟1中得到的質(zhì)粒為模板，以含EcoR I酶切位點(diǎn)的F35S :GC GAATTCTCGACGAATTAATTCCAATCCCACA (SEQ ID NO: 5)和含Sac I及Nco I酶切位點(diǎn)的R35S : CCGAGCTCCCATGGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATG(SEQ ID NO:6)為引物（上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司），以EasyPfu DNA Polymerase(購(gòu)自TransGen Biotech公司）為酶進(jìn)行擴(kuò) 增反應(yīng)。
[0047] PCR反應(yīng)體系及條件如下：質(zhì)粒模板（pHANNIBAL載體）lyL，正反向引物各 1.5 μL，EasyPfu DNA Polymerase 1 μL，10XEasyPfu Buffer 5 μL，2. 5mM dNTPs 5 μL，去 離子水35 yL，總反應(yīng)體系50 μ1。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性：94°C 4min，變性：94°C 30sec， 退火：50°C 30sec，延伸：72°C lmin 30sec繼續(xù)延伸：72°C lOmin，其中變性-退火-延伸經(jīng) 歷35個(gè)循環(huán)。
[0048] 獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大小為1346bp的條帶，利用 pEasyTM-BluntZero試劑盒（購(gòu)自TransGenBiotech)，連接BluntZero載體（購(gòu)自 TransGenBiotech)，轉(zhuǎn)化Transl-Tl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
[0049] 挑取單克隆，37°C培養(yǎng)4小時(shí)后進(jìn)行PCR鑒定并送單克隆測(cè)序（上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司），選取測(cè)序正確的含SEQIDNO: 1序列的單克隆提取質(zhì)粒，方法參照 本實(shí)施例（1)，獲得中間載體Blunt-CMV。
[0050] 3. 0CS終止子克隆
[0051] 以本實(shí)施例的前述步驟1中得到的質(zhì)粒為模板，以含Xba I和Sal I酶切位點(diǎn) 的0CSF :GCTCTAGACACGTGGTCGACGTCCTGCTTTAA(SEQ ID NO:7)和含Hind III酶切位點(diǎn)的 0CSR：AGAAGCTTAGATTTAGGTGACACTATAGAA(SEQ ID NO:8)為引物（上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司），以EasyPfu DNA Polymerase為酶進(jìn)行反應(yīng)。
[0052] PCR反應(yīng)體系及條件如下：質(zhì)粒模板（pHANNIBAL載體）lyL，正反向引物各 1.5 μL，EasyPfu DNA Polymerase 1 μL，10XEasyPfu Buffer 5 μL，2. 5mM dNTPs 5 μL，去 離子水35 yL，總反應(yīng)體系50 μ1。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性：94°C 4min，變性：94°C 30sec， 退火：50°C 30sec，延伸：72°C 50sec繼續(xù)延伸：72°C 10min，其中變性-退火-延伸經(jīng)歷35 個(gè)循環(huán)。
[0053] 獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大小為766bp的條帶，利用全式金的 pEasyTM-BluntZero試劑盒，連接BluntZero載體，轉(zhuǎn)化Transl-Tl大腸桿菌感受態(tài)細(xì) 胞。挑取單克隆，37°C培養(yǎng)4小時(shí)后進(jìn)行PCR鑒定并送單克隆測(cè)序（上海生工生物工程技 術(shù)服務(wù)有限公司），選取測(cè)序正確的含SEQIDN0:3序列的單克隆提取質(zhì)粒，參照本實(shí)施例 1，獲得中間載體Blunt-〇CS。
[0054] 實(shí)施例2:pC1300-pHANNIBAL載體的構(gòu)建
[0055] 1. 1300-CMV載體的構(gòu)建
[0056] 利用EcoRI和SacI分別雙酶切兩種質(zhì)粒。酶切體系如下：
[0057]
[0059] 配制完成上述混合液后，輕輕吹打混勻，37°C培養(yǎng)箱孵育3. 5小時(shí)，然后電泳、膠 回收、連接。
[0060] 根據(jù)電泳后目的條帶亮度，按照片段與載體摩爾比為3 :1~7 :1的量加入相應(yīng)體 積的膠回收溶液，利用T4連接酶，將CMV連入pCAMBIA1300載體。連接體系如下：
[0061]
[0062] 配制完成上述混合液后，輕輕吹打混勻，16°C過(guò)夜連接（大約8~9小時(shí)）。連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-Tl大腸桿菌，挑取單克隆，經(jīng)測(cè)序正確后，最終獲得1300-CMV載體。
[0063] 2. 1300-CMV-0CS載體的構(gòu)建
[0064] 利用Xba I和Hind III分別雙酶切兩種質(zhì)粒。酶切體系同本實(shí)施例中1;制完成 上述混合液后，輕輕吹打混勻；37°C培養(yǎng)箱孵育3. 5小時(shí)，后電泳、膠回收、連接。
[0065] 根據(jù)電泳后目的條帶亮度，按照片段與載體摩爾比為3 :1~7 :1的量加入相應(yīng)體 積的膠回收溶液，利用T4連接酶，將0CS連入1300-CMV載體。連接體系同本實(shí)施例中前述 步驟1;配制完成上述混合液后，輕輕吹打混勻；16°C過(guò)夜連接（大約8~9小時(shí)）。連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化Transl-Tl大腸桿菌，挑取單克隆，經(jīng)測(cè)序正確后，最終獲得1300-CMV-0CS載體。
[0066] 3.pC1300-pHANNIBAL載體的構(gòu)建
[0067] 利用ΚρηI和BamHI分別雙酶切兩種質(zhì)粒。酶切體系同本實(shí)施例中1;制完成上 述混合液后，輕輕吹打混勻；37°C培養(yǎng)箱孵育3. 5小時(shí)，后電泳、膠回收、連接。
[0068] 根據(jù)電泳后目的條帶亮度，按照片段與載體摩爾比為3 :1~7 :1的量加入相應(yīng)體 積的膠回收溶液，利用T4連接酶，將PDK連入1300-CMV-0CS載體。連接體系連接體系同本 實(shí)施例中1 ;配制完成上述混合液后，輕輕吹打混勻；16°C過(guò)夜連接（大約8~9小時(shí)）。連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-Tl大腸桿菌，挑取單克隆，經(jīng)測(cè)序正確后，最終獲得pC1300-pHANNIBAL 載體，示意圖如圖1所示。
[0069] 實(shí)施例3 :青蒿中TAR1基因RNAi載體構(gòu)建及應(yīng)用
[0070] 1.TARl-RNAi載體構(gòu)建
[0071] 從NCBI上獲得TAR1序列（EZ159016)，靠近3'端設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的正向引物TA Rl-RNAiF:aaaTCTAGAaaaCCATGGcctcttaacaagccagagtc(SEQIDNO:9)(含NcoIandXba I酶切位點(diǎn)）和反向引物TARl-RNAiR:aaaGGATCCaaaGGTACCccttRRatRagatacactgtc(SEQ IDN0:10)(含BamHIandKpnI酶切位點(diǎn)），利用EasyPfuDNAPolymerase酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR體系及條件參照實(shí)施例2,延伸時(shí)間為30sec。
[0072] 先用NcoI和ΚρηI雙酶切本實(shí)施例中上步所得TAR1基因片段質(zhì)粒和實(shí)施例2 中所得pC1300-pHANNIBAL載體的質(zhì)粒，膠回收，用Τ4連接酶連接，將TAR1基因片段正向連 入pC1300-pHANNIBAL，獲得 35S:TAR1F: :PDK: :0CS載體；然后用BamHI和XbaI酶切TAR1 基因片段質(zhì)粒和35S:TAR1F: :PDK: : 0CS載體，膠回收并用T4連接酶連接，將TAR1基因片段 反向連入35S:TAR1F: :PDK: :0CS，獲得TARl-RNAi終載體。示意圖如圖2所示。
[0073] 2. TARl-RNAi載體轉(zhuǎn)化青蒿外植體
[0074] 提取TARl-RNAi質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn) 化青蒿外植體。分別用愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（6-BA0. 5mg/L，NAA0.05mg/L，潮霉素30mg/L和 羧芐西林鈉500mg/L)，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（6-BA0· 5mg/L，NAA0· 05mg/L，潮霉素50mg/L和 羧芐西林鈉500mg/L)，生根培養(yǎng)基（1/2MS+潮霉素100mg/L)培養(yǎng)青蒿外植體，最終獲得潮 霉素抗性再生青蒿植株。
[0075] 3. TARl-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿分子鑒定
[0076]提取TARl-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿的DNA，以JDFOKF:acagtggtcccaaagatgga(SEQID NO: 11)和JDFOK-IR:cttcttcgtcttacacatcac(SEQIDNO: 12)為引物，利用rTaq酶進(jìn)行PCR 鑒定。PCR鑒定體系如下：
[0077]
[0078] 反應(yīng)條件如下：
[0079]
[0080]PCR鑒定電泳結(jié)果如圖3所示，圖3中含有700bp特異條帶的株系為陽(yáng)性植株，P 表示以TARl-RNAi質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照，Μ為DNA分子標(biāo)記（MakerDL2000)，N表示以野 生型青蒿DNA為模板的陰性對(duì)照。
[0081] 選取PCR鑒定為陽(yáng)性的植株，提取RNA ;利用反轉(zhuǎn)錄TansScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒（購(gòu)自TransGen Biotech)反轉(zhuǎn)成cDNA;以cDNA為模板， 進(jìn)行定量PCR(qRT-PCR)，檢測(cè)TAR1基因表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果如圖4所示，篩選出TAR1 基因明顯降低的株系，進(jìn)行后續(xù)TARl-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿含量測(cè)定。
[0082] 4.TARl-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿含量測(cè)定
[0083] 選取陽(yáng)性TARl-RNAi轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行青蒿素，青蒿酸和二氫青蒿酸含量測(cè)定。同 時(shí)取野生型青蒿作為對(duì)照。分別收集轉(zhuǎn)基因及野生型青蒿新鮮葉片及花苞材料，過(guò)夜烘干， 充分研磨材料，稱取約0.lg干粉于2mLEppendorf管中，加入1. 5mL乙醇，用40W超聲波處 理30min，5000rpm離心lOmin，取上清用0. 22μηι濾膜過(guò)濾。濾液可直接用于液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜分析儀（LC-MS/MS)，進(jìn)行含量測(cè)定。含量計(jì)算方法：兩點(diǎn)法，計(jì)算公式:六。/(：。=Ax/Cx。 含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示。
[0084] 結(jié)果表明，TARl-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿葉中青蒿素、青蒿酸和二氫青蒿酸的含