量均低于 野生型青蒿植株葉中的含量；而相應(yīng)植株花苞中青蒿素、青蒿酸和二氫青蒿酸的量也低于 野生型青蒿植株。說(shuō)明在青蒿中TAR1基因的沉默導(dǎo)致青蒿素、青蒿酸和二氫青蒿酸的含量 降低。
[0085] 實(shí)施例4:菘藍(lán)中PLR基因RNAi載體構(gòu)建及應(yīng)用
[0086] 1. PLR-RNAi載體構(gòu)建
[0087]根據(jù)PLR基因的序列（JF264893)，在其非保守區(qū)域設(shè)計(jì)含NcoI和SalI酶切 位點(diǎn)的正向引物PLR1-F:CCATGGGTCGACTGCCTCCGGGAAGAGAA(SEQIDNO: 13)，含ΚρηI和BamHI酶切位點(diǎn)的反向引物PLRl-R:GGTACCGGATCCGAGTTTAGAAGCTTCTT(SEQIDN0:14)，利 用EasyPfuDNAPolymerase酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系及條件參照實(shí)施例2,延伸時(shí)間為 30sec〇
[0088] 先用SalI和BamHI雙酶切本實(shí)施例中上步所得PLR基因片段質(zhì)粒和實(shí)施例2 中所得pC1300-pHANNIBAL載體的質(zhì)粒，膠回收，用T4連接酶連接，將PLR基因片段正向連 入pC1300-pHANNIBAL，獲得 35S:PLRF: :PDK: :0CS載體；然后用NcoI和ΚρηI酶切PLR基 因片段質(zhì)粒和35S:PLRF: :TOK: : 0CS載體，膠回收并用Τ4連接酶連接，將PLR基因片段反向 連入35S:PLRF: :TOK: : 0CS，獲得同時(shí)插入正反向片段的PLR-RNAi終載體。示意圖如圖6所 不。
[0089] 2.PLR-RNAi載體轉(zhuǎn)化菘藍(lán)外植體
[0090] 提取PLR-RNAi質(zhì)粒，取5-10μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C58C1感受態(tài)細(xì)胞，利用葉盤法轉(zhuǎn)化菘 藍(lán)外植體。利用活化的C58C1菌液浸染剪成lcm2的菘藍(lán)葉盤，然后取出，接種于共培養(yǎng)培 養(yǎng)基（MS)上，置于恒溫培養(yǎng)箱中（25 土 1)°C暗培養(yǎng)2d。然后用無(wú)菌水沖洗5次轉(zhuǎn)移至除 菌培養(yǎng)基上（1/2MS+Cef500mg/L)于（25 土 1)°C暗培養(yǎng)，約15d后，從葉盤傷口邊緣長(zhǎng)出毛 狀根，每隔7d繼代一次，并不斷降低Cef濃度（250mg/L- 100mg/L- 50mg/L-Omg/L)反 復(fù)繼代除菌。用潮霉素（HygrlOmg/L)進(jìn)行篩選。
[0091] 挑選生長(zhǎng)迅速、狀態(tài)良好的發(fā)根系轉(zhuǎn)入1/2MS液體培養(yǎng)基，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（避光，120rpm)，45d收獲毛狀根用于后續(xù)分析。DNA提取、RNA提取、化合物 提取和間苯三酚一鹽酸染色。
[0092] 3.PLR-RNAi菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定
[0093] 提取發(fā)根總DNA，以表1中的三對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定體系參照實(shí)施例3中的 (3)。反應(yīng)完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0094] PCR鑒定電泳結(jié)果如圖7所示，圖中同時(shí)包含rolb，hpt和JDTOK條帶的株系為陽(yáng) 性植株，P表示陽(yáng)性對(duì)照，Μ為DNA分子標(biāo)記（MakerDL2000)，CK為空載體對(duì)照，WT為野生 型。
[0095] 表1PLR-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定引物序列
[0096]
[0097] 選取PCR鑒定為陽(yáng)性的植株，提取RNA ;利用反轉(zhuǎn)錄TansScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA ;以cDNA為模板，進(jìn)行定量PCR(qRT-PCR)， 檢測(cè)PLR基因表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果如圖8所示，篩選出PLR基因明顯降低的株系，進(jìn)行 后續(xù)PLR-RNAi落葉松脂素含量測(cè)定。
[0098] 4. PLR-RNAi菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因毛狀根含量測(cè)定
[0099] 通過(guò)LC/MS/MS測(cè)定PLR-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中落葉松脂素的含量。含量測(cè)定結(jié)果 如圖9A所示。結(jié)果顯示與WT及CK相比，PLR-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根中落葉松脂素的含量顯 著降低（P〈〇.05)。通過(guò)間苯三酚-鹽酸染色，發(fā)現(xiàn)PLR-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根上色程度明顯變 弱，如圖9B所示。以上結(jié)果說(shuō)明PLRl-RNAi轉(zhuǎn)基因毛狀根具有較少的木脂素和酚類衍生物 積累，表明PLR表達(dá)下調(diào)會(huì)降低落葉松脂素的生物合成，
[0100] 總之，本發(fā)明提供了一種植物雙元表達(dá)基因沉默的RNAi載體-- pC1300-pHANNIBAL載體。該載體可廣泛用于多種植物目標(biāo)基因的沉默及生物學(xué)功能研究， 對(duì)于開展植物技術(shù)工程意義重大。上述實(shí)施例表明，該載體已經(jīng)成功用于青蒿中TAR1基 因、菘藍(lán)中PLR基因以及丹參MYC2a、MYC2b等基因的沉默，實(shí)現(xiàn)青蒿中青蒿素、青蒿酸和二 氫青蒿酸含量的降低，菘藍(lán)中落葉松脂素含量的下降和丹參中丹酚酸等化合物含量減少。 隨著基因工程技術(shù)的推廣，pC1300-pHANNIBAL載體在基礎(chǔ)研究和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用將會(huì)越 來(lái)越廣泛。
[0101] 以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造做了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改 或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可 作出種種等同的變型或替換，這些均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，該載體以植物雙元表達(dá)載體 PCAMBIA1300為基礎(chǔ)，在多克隆位點(diǎn)處插入來(lái)源于pHANNIBAL載體的CMV啟動(dòng)子、TOK內(nèi)含 子和OCS終止子，形成pC1300-pHANNIBAL載體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，其特征 在于，其中所述CMV和OCS通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，經(jīng)酶切、連接依次插pCAMBIA1300,獲得 PC1300-CMV-0CS;所述PDK直接從pHANNIBAL酶切獲得，然后插入pC1300-CMV-0CS的CMV 和OCS之間，獲得pC1300-pHANNIBAL。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，其特征在于， 該載體中，所述CMV和PDK之間含有3個(gè)多克隆酶切位點(diǎn)SacI，NcoI及ΚρηI，正向插入 目標(biāo)基因的片段；PDK和0CS之間含有4個(gè)酶切位點(diǎn)HindIII，BamHI，XbaI和SalI，其 中BamHI，XbaI和SalI為單酶切位點(diǎn)，反向插入目標(biāo)基因的片段。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，其特征在于， 其中所述的CMV啟動(dòng)子，其核苷酸序列為SEQIDNO: 1所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，其特征在于， 其中所述的Η)Κ內(nèi)含子，其核苷酸序列為SEQIDNO:2所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，其特征在于， 其中所述的0CS終止子，其核苷酸序列為SEQIDNO:3所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體，其特征在于， 其中所述的pC1300-pHANNIBAL載體，其核苷酸序列為SEQIDN0:4所示。8. 權(quán)利要求1所述的廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體的構(gòu)建方法，包含以下步 驟： 步驟一，利用F35S，R35S擴(kuò)增pHANNIBAL上的啟動(dòng)子CMV，連接Blunt-zero載體，獲得 正確的中間載體Blunt-CMV; 步驟二，雙酶切Blunt-CMV，連接到pCAMBIA1300上，得到1300-CMV; 步驟三，利用OCSF，0CSR擴(kuò)增pHANNIBAL上的終止子0CS，連接Blunt-zero載體，獲得 正確的中間載體Blunt-OCS; 步驟四，雙酶切Blunt-OCS，連接到1300-CMV上，得到1300-CMV-OCS; 步驟五，雙酶切pHANNIBAL上的PDK片段，連接到1300-CMV-OCS上，最終構(gòu)建獲得pC1300-pHANNIBAL載體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體的構(gòu)建方法，其特征 在于，其中步驟一所述的利用F35S，R35S擴(kuò)增pHANNIBAL上的啟動(dòng)子CMV是指以含EcoRI 酶切位點(diǎn)的F35S和含SacI及NcoI酶切位點(diǎn)的R35S為引物，所述F35S如SEQIDN0:5 所示，R35S如SEQIDNO:6所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體的構(gòu)建方法，其特 征在于，其中步驟三所述的利用OCSF，0CSR擴(kuò)增pHANNIBAL上的終止子0CS是指以含Xba I和SalI酶切位點(diǎn)的0CSF和含HindIII酶切位點(diǎn)的0CSR為引物，所述0CSF如SEQID NO:7 所示，0CSR如SEQIDNO:8 所示。11. 一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含SEQIDN0:4所示的基因。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或 農(nóng)桿菌。13. 權(quán)利要求1中所述的廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng) 用。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體在基因轉(zhuǎn)化中的 應(yīng)用，其特征在于，所述的RNAi載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用是指RNAi載體在制備轉(zhuǎn)基因植物 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種廣泛用于多種植物基因沉默的RNAi載體及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的載體以pCAMBIA1300載體為骨架，插入pHANNIBAL載體上的Promoter(CMV)，PDK和Terminator？1(OCS)序列，載體構(gòu)建包括如下步驟：一，通過(guò)PCR擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶酶切、連接技術(shù)，將含有酶切位點(diǎn)的CMV和OCS依次連入pCAMBIA1300載體；二，在CMV和OCS之間插入PDK，最終形成pC1300-pHANNIBAL載體。本發(fā)明所涉及的載體是一種可以整合到植物基因組并可在植物宿主細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳、表達(dá)的雙元表達(dá)載體，且是方便、可靠、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的基因沉默手段。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/66, C12N1/21, C12N15/82
【公開號(hào)】CN105274135
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510521004
【發(fā)明人】譚何新, 張磊, 肖玲, 邸鵬, 肖瑩
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年8月24日