一株連翹內(nèi)生細(xì)菌lq-a及其分離、純化方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株連翅內(nèi)生細(xì)菌，具體的說(shuō)是一株連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A及其分離、純 化方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 連翅出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，其別名又有旱連子、空翅、落翅、黃奇丹，為木犀科植物連 翅Forsythia suspense的干燥果實(shí)，是中國(guó)臨床常用傳統(tǒng)中藥之一，具有有抗菌、強(qiáng)屯、、 利尿、鎮(zhèn)吐等藥理作用，常用其治療急性風(fēng)熱感冒、淋己結(jié)結(jié)核、尿路感染等癥，有廣譜抗菌 作用，是各中藥復(fù)方(為雙黃連口服液、清熱解毒口服液、銀翅解毒沖劑）中的主要組成藥 物，國(guó)內(nèi)外已對(duì)連翅葉化學(xué)成分進(jìn)行了相關(guān)研究，然而對(duì)連翅內(nèi)生菌的研究甚少，對(duì)連翅內(nèi) 生菌代謝產(chǎn)物的研究更是微乎其微。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問(wèn)題的不足，提供一種連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A及其分 離、純化方法和應(yīng)用。
[0004] 一株連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A，分類命名為枯草芽抱桿菌（歷suA。知苗，已保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏日期為2015年05月13日，保藏 編號(hào)為CGMCCNo. 10805。
[0005] 所述的連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的分離與純化方法，包括W下步驟： 1、 原料及用具的準(zhǔn)備 (1) 新鮮連翅葉：采新鮮連翅葉，用塑料袋包裹，置于0- 4°C冰箱中保存，備用； (2) 研鉢和研棒：洗凈用報(bào)紙包扎好，12rC滅菌30min，備用； (3) 培養(yǎng)皿、錐形瓶和試管：洗凈用報(bào)紙包扎好，12rC滅菌30min，備用； (4) IOml和Iml移液管：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； (5) 50ml和100mL燒杯：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； 2、 培養(yǎng)基及化學(xué)試劑的配制 (1) 培養(yǎng)基：肉汁腺培養(yǎng)基（BPA):每1000mL培養(yǎng)基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺 5.0邑、酵母膏1.0邑、葡萄糖10.0邑和瓊脂18-20邑，余量為蒸饋水；0.謹(jǐn)口曰，115°(：高溫滅菌 SOmin； 肉汁腺液體培養(yǎng)基：每1000mL培養(yǎng)基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺5.Og、酵母膏1.Og和葡萄糖10.Og,余量為蒸饋水；0.IMPa, 115°C高溫滅菌30min; (2) 化學(xué)試劑的配制 濃度為Imol/L的化OH水溶液：稱取4g化OH用80血水溶解，定容至100血； 7%Hcl:量取70%Hcl10血，定容至100血；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液：量取99%無(wú)水 乙醇75mU用無(wú)菌去離子水定容至IOOmL;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.l%HgCl2水溶液：稱取0. 1巧gCl2 用80血水溶解，加水定容至100血；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaC10水溶液：量取10%的化ClO50血， 加入定容至100mL; 3、操作方法 (1) 稱量并且表面消毒 稱連翅葉片5g，用自來(lái)水沖洗干凈，在無(wú)菌操作臺(tái)上，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶 液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.l%HgCl2水溶液對(duì)翅葉片的表面進(jìn)行消毒5分鐘，再用無(wú)菌水漂洗翅葉 片4次； (2) 檢驗(yàn)消毒效果 取最后一次無(wú)菌水沖洗液，涂布到BPA平板上，37°C培養(yǎng)3天，檢驗(yàn)滅菌效果；若發(fā)現(xiàn)皿 中無(wú)菌落出現(xiàn)，證明該葉片表面滅菌徹底，否則該分離結(jié)果不能使用； (3) 樣品處理 用滅過(guò)菌的剪刀將葉片剪成IOmm的正方形，置于研鉢中，加15ml無(wú)菌水反復(fù)研磨搗 碎，靜置30min鐘后，用無(wú)菌移液管取Iml上清液置于IOml試管中，加水梯度稀釋到濃度為 10 1-10 4,得到不同濃度的稀釋液；用無(wú)菌移液管分別取0. 2ml不同濃度的稀釋液涂布于肉 汁腺培養(yǎng)基平板上，每濃度涂平皿一個(gè)，重復(fù)3次，至于37°C溫箱中培養(yǎng)； (4) 純化 培養(yǎng)3-5d后，挑取不同形態(tài)的菌落在固體平板上劃線純化，直到分離得到單菌落； (5) 鏡檢 挑取單菌落固定在載玻片上，用革蘭氏染色法進(jìn)行染色，干燥后，滴加香柏油，在高倍 鏡下觀察菌落形態(tài)； (6) 保存 挑取鏡檢時(shí)所用的單菌落接種于含有BPA液體培養(yǎng)基的S角瓶中，在37°C15化/min搖床中培養(yǎng)12h，至細(xì)菌長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，薩取菌懸液接種于斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2d，在試 管中觀察到S型的菌種，再轉(zhuǎn)移到4°C的冰箱中斜面真空冷凍干燥保存，即得到連翅內(nèi)生細(xì) 菌LQ-A。
[0006] 所述革蘭氏染色法為，草酸錠結(jié)晶紫染色I(xiàn)min,自來(lái)水沖洗，艦液染Imin,水洗， 95%的酒精脫色20s，水洗，番紅復(fù)染2min，水洗。
[0007] 所述的連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A制備涂膜保鮮劑的方法，包括步驟如下：收集連翅內(nèi)生 細(xì)菌A發(fā)酵上清液，離屯、收集上清，0. 45ym濾膜過(guò)濾；然后按照濾液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的明 膠的體積比為2:1，將濾液添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的明膠中，混合均勻后，即制備出涂膜保鮮 劑。
[000引有益效果是： 本發(fā)明采用表面滅菌研磨的方法處理新鮮連翅葉片，分離純化得到具有潛在研究?jī)r(jià)值 的連翅內(nèi)生細(xì)菌。W此菌株為原材料進(jìn)行研究。首先進(jìn)行分離純化，抑菌試驗(yàn)，采用傳統(tǒng)形 態(tài)學(xué)給予初步鑒定，然后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，提取菌株DNA，運(yùn)用凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物，將產(chǎn)物送去測(cè)序中屯、進(jìn)行測(cè)序并鑒定，確定該株連翅內(nèi)生細(xì)菌屬于枯草芽抱桿菌屬。 將該菌發(fā)酵取上清做抑菌試驗(yàn)，發(fā)酵上清液僅對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，而其他的測(cè) 試菌均無(wú)抑制作用，運(yùn)為該菌株在食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
[0009] 生物材料的保藏 連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A，分類命名為枯草芽抱桿菌（歷suAfWis)，保藏日期為 2015年05月13日，保藏單位及其簡(jiǎn)稱為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10805,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的單菌落鏡檢圖； 圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用圖； 圖3為本發(fā)明連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的鏡檢圖； 圖4為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的ISsrDNA電泳圖； 圖中標(biāo)記是：M為marker,A為連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A; 圖5為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 一株連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A，分類命名為枯草芽抱桿菌（歷suA。知苗，已保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏日期為2015年05月13日，保藏 編號(hào)為CGMCCNo. 10805。
[0012] 所述的連翅內(nèi)生細(xì)菌LQ-A的分離與純化方法，包括W下步驟： 1、 原料及用具的準(zhǔn)備 (1) 新鮮連翅葉：采新鮮連翅葉(采自河南科技大學(xué)周山校區(qū)一號(hào)教學(xué)樓前的花園）， 用塑料袋包裹，置于0- 4°C冰箱中保存，備用； (2) 研鉢和研棒：洗凈用報(bào)紙包扎好，12rc滅菌30min，備用； (3) 培養(yǎng)皿、錐形瓶和試管：洗凈用報(bào)紙包扎好，12rC滅菌30min，備用； (4) IOml和Iml移液管：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； (5) 50ml和100mL燒杯：洗凈用報(bào)紙包扎好，121°C滅菌30min，備用； 2、 培養(yǎng)基及化學(xué)試劑的配制 (1) 培養(yǎng)基：肉汁腺培養(yǎng)基（BPA):每1000mL培養(yǎng)基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺 5.Og、酵母膏1.Og、葡萄糖10.Og和瓊脂18-20g，余量為蒸饋水；0.IMPa, 115°C高溫滅菌 SOmin; 肉汁腺液體培養(yǎng)基：每1000HiL培養(yǎng)基中添加牛肉浸膏3.Og、蛋白腺5.Og、酵母膏1.Og和葡萄糖10.Og,余量為蒸饋水；0.IMPa, 115°C高溫滅菌30min; (2) 化學(xué)試劑的配制 濃度為Imol/L的化OH水溶液：稱取4g化OH用80血水溶解，定容至100血； 7%Hcl:量取70%Hcl10血，定容至100血；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液：量取99%無(wú)水 乙醇75mU用無(wú)菌去離子水定容至IOOmL;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.l%HgCl2水溶液：稱取0. 1巧gCl2 用80血水溶解，加水定容至100血；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaC10水溶液：量取10%的化ClO50血， 加入定容至100HiL; 3、操作方法 (1)稱量并且表面消毒 稱連翅葉片5g，用自來(lái)水沖洗干凈，在無(wú)菌操作臺(tái)上，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶 液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.l%HgCl2水溶液對(duì)翅葉片的表面進(jìn)行消毒5分鐘，再用無(wú)菌水漂洗翅葉 片4次； (2) 檢驗(yàn)消毒效果 取最后一次無(wú)菌水沖洗液，涂布到BPA平板上，37°C培養(yǎng)3天，檢驗(yàn)滅菌效果；若發(fā)現(xiàn)皿 中無(wú)菌落出現(xiàn)，證明該葉片表面滅菌徹底，否則該分離結(jié)果不能使用； (3) 樣品處理 用滅過(guò)菌的剪刀將葉片剪成IOmm的正方形，置于研鉢中，加15ml無(wú)菌水反復(fù)研磨搗 碎，靜置30min鐘后，用無(wú)菌移液管取Iml上清液置于IOml試管中，加水梯度稀釋到濃度為 10 1-