Alkbh2基因在缺血性腦卒中診斷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及ALKBH2基因在缺血性腦卒中診斷中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 缺血性腦卒中是指突然發(fā)生的腦局部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致腦組織缺血缺氧引起的 局灶性神經(jīng)功能缺損綜合征。有四種類型的腦缺血：短暫性腦缺血發(fā)作、可逆性神經(jīng)功能障 礙、進(jìn)展性卒中、完全性卒中。缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)三大死亡疾病之一，也是成年人 首位致殘原因。由于目前缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，且臨床上用于治療缺血 性腦卒中的手段有限，使得該病不僅發(fā)病率高，致死率、致殘率及復(fù)發(fā)率也較高。
[0003] 缺血性腦卒中是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜性疾病，隨著人類基因組計 劃的完成和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，基因的研究受到廣泛重視，尋找疾病的基因標(biāo)記物成為當(dāng) 前研究的熱點。今年來，越來越多研究認(rèn)為，基因在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中起著重 要的調(diào)控作用，因此基因與缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系也備受關(guān)注。
[0004] 目前臨床上用于缺血性腦卒中診斷的方法包括：頭顱CT及MRI掃描、腦血管檢查 (數(shù)字減影血管造影DSA、CT或MR血管成像）、經(jīng)顱多普勒檢查。但是上述方法的使用不能 提供一種特異和敏感的診斷，盡管現(xiàn)在報道了一些與缺血性腦卒中相關(guān)的基因，但是并沒 有應(yīng)用到臨床上，因此發(fā)現(xiàn)一種特異性的缺血性腦卒中標(biāo)記物應(yīng)用于臨床診斷具有重要的 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于缺血性腦卒中早期 診斷的分子標(biāo)志物-ALKBH2基因。相比傳統(tǒng)的缺血性腦卒中的診斷方法，使用基因標(biāo)志物 來診斷缺血性腦卒中具有及時性、特異性和靈敏性，使患者在疾病早期就能知曉風(fēng)險，針對 風(fēng)險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007]本發(fā)明提供了一種ALKBH2基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
[0008] 進(jìn)一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位 雜交或芯片檢測ALKBH2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。
[0009] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增ALKBH2 基因的引物；所述用實時定量PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增ALKBH2 基因的引物；所述用免疫檢測診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括：與ALKBH2蛋白特異性結(jié)合的 抗體；所述用原位雜交診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括：與ALKBH2基因的核酸序列雜交的探 針；所述用芯片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括 與ALKBH2蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與ALKBH2基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 進(jìn)一步，所述診斷產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒；其中所述芯片包括基因芯片、蛋白 質(zhì)芯片；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒。所述基因檢測試劑盒包 括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增ALKBH2基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBRGreen熒光染料。
[0011] 本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品能夠通過檢測ALKBH2 基因的表達(dá)水平來診斷缺血性腦卒中。
[0012] 進(jìn)一步，上面所述的產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白 質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷 酸探針包括用于檢測ALKBH2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對ALKBH2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白 質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的ALKBH2蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包 括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測ALKBH2基 因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括ALKBH2蛋白的特異性抗體。其中，所述 基因芯片可用于檢測包括ALKBH2基因在內(nèi)的多個基因（例如，與缺血性腦卒中相關(guān)的多個 基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括ALKBH2蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)（例 如與缺血性腦卒中相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個與缺血性腦卒中的標(biāo)志物 同時檢測，可大大提高缺血性腦卒中診斷的準(zhǔn)確率。
[0013] 進(jìn)一步，上面所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯 片方法檢測ALKBH2基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對ALKBH2 基因的引物和/或探針。
[0014] 進(jìn)一步，所述基因檢測試劑盒包含SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增 ALKBH2基因和管家基因的引物對；所述SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含：PCR緩沖液、 dNTPs、SYBRGreen熒光染料。所述擴(kuò)增ALKBH2基因的引物對序列如下：正向引物序列為 5' -TGGACAGACCTTCAACTT-3' ；反向引物序列為 5' -TTCATCATCTCGGTGCTC-3' ；所述管家基因 為GAPDH，擴(kuò)增GAPDH的引物序列對如下：正向引物序列為5' -CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3' ； 反向引物序列為 5' -GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。
[0015] 進(jìn)一步，所述基因檢測試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，所述逆轉(zhuǎn)錄體系包括T重 復(fù)寡核苷酸OligodT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。所述基因檢 測試劑盒可用于檢測包括ALKBH2基因在內(nèi)的多個基因（例如，與缺血性腦卒中相關(guān)的多個 基因）的表達(dá)水平。
[0016] 本發(fā)明中與ALKBH2基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、 PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特 異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同 樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同 的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基 對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所 述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0017] 本發(fā)明中所述ALKBH2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 ALKBH2蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、 80?￥、？813、？(313'）2、？￥等。只要所述片段能夠保留與4〇^!12蛋白的結(jié)合能力即可。用于 檢測蛋白質(zhì)水平的抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來 制備所述抗體，如所述的片段可以通過化學(xué)法從頭合成或利用重組DNA技術(shù)合成。
[0018] 在本發(fā)明的上下文中，"ALKBH2基因"包括人ALKBH2基因以及人ALKBH2基因的任 何功能等同物的多核苷酸。ALKBH2基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中 ALKBH2基因（NC_000012. 12)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA 序列；
[0019] 優(yōu)選地，ALKBH2基因的編碼序列包括以下任一種DNA分子：
[0020] (1)序列表中SEQIDNO. 1所示的DNA序列；
[0021] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0022] (3)與（1)或⑵限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0023] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述ALKBH2基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0024] 本發(fā)明的ALKBH2基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá)ALKBH2 的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0025] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）載體、甲病毒載 體。
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