一種分子印跡材料的合成方法及其在煙葉中茄尼醇分離中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明了一種天然產(chǎn)物中活性成分的提取方法，即將分子印跡聚合物用于制 備色譜，從天然產(chǎn)物中直接提取高純度的活性成分，即分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymers，MIPs)結(jié)合中低壓制備色譜（Flash Chromatography)的體系，用于 天然產(chǎn)物中活性成分的快速、大量制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子印跡聚合物是指由功能單體、模板分子、交聯(lián)劑之間通過相互作用形成的聚 合物。其攜帶有對模板的上億個特異性結(jié)合位點，能夠識別和特異性結(jié)合目標(biāo)物。分子印 跡聚合物因其對特定分子的特異性識別和選擇性結(jié)合能力，可用于眾多領(lǐng)域，包括分離和 純化、傳感及生物傳感、催化、藥物載體等。就其分離和純化應(yīng)用來說，分子印跡近年來被廣 泛應(yīng)用于固相萃取，用于分析檢測前樣品的富集和純化，但很少有其在大批量制備方面的 應(yīng)用。
[0003] 制備色譜的首次報道是在1879年，由W. C. Still用于在有機(jī)合成后目標(biāo)物的純 化。因其具有低成本、耗時短、高產(chǎn)等優(yōu)點，此后被廣泛應(yīng)用于有機(jī)反應(yīng)后處理、天然產(chǎn)物提 取、樣品富集和純化等。但是傳統(tǒng)固定相（如硅膠、聚酰胺、氧化鋁、水凝膠等）的固有缺陷 如吸附性低、壽命短等嚴(yán)重影響其產(chǎn)物的純度和分離成本。
[0004] 從天然產(chǎn)物中提取高純度的有效成分一直研究熱點，為此近年來研究者已開發(fā)出 很多色譜技術(shù)，如高速逆流色譜、超臨界流體色譜、模擬移動床色譜等，成功用于天然產(chǎn)物 中活性成分如皂苷、百里香、甘草酸、鏈留醇等的分離，產(chǎn)物純度可達(dá)95%。然而以上色譜技 術(shù)因耗時、溶劑需求量大、成本高等，在大量制備方面并未得到廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明將分子印跡技術(shù)和制備色譜結(jié)合起來，目的是為天然產(chǎn)物中活性成分的提 取，提供一種快速、大量的制備方法，以解決傳統(tǒng)方法成本高、步驟復(fù)雜、產(chǎn)物純度低等問 題。
[0006] 技術(shù)方案如下：
[0007] 正向懸浮聚合的制備茄尼醇分子印跡聚合物：將一定量的模板、單體、交聯(lián)劑溶于 有機(jī)溶劑，得到分散相；連續(xù)相：將一定量表面活性劑溶于超純水中。制備條件：在一定機(jī) 械攪拌速度下、惰性氣體除氧、50~90°C下、聚合3~8小時。
[0008] 優(yōu)化后的分子印跡制備色譜條件，用于提取煙葉中茄尼醇。其具體方法操作如下： 將粗提的煙葉萃取物用有機(jī)溶劑定容至一定濃度，以一定流速上樣，切換流動相用洗脫溶 劑以一定流速洗脫，最后用有機(jī)溶劑沖凈系統(tǒng)中的洗脫溶劑，收集洗脫部分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)， 得到白色固體，即茄尼醇。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0010] (1)本實驗的原料為煙葉，其來源穩(wěn)定，成本低廉，并且預(yù)處理方法簡便；
[0011] (2)本提取方案提取效率，產(chǎn)物純度高達(dá)98 %，提取溶劑可以回收使用，極大降低 了成本而且避免了環(huán)境污染；
[0012] (3)本實驗中所用的分子印跡聚合物，吸附性強(qiáng)、選擇性高、使用壽命長，可重復(fù)利 用；
[0013] (4)本實驗所建立的天然產(chǎn)物的提取方法，具有普適性，可用于其他天然產(chǎn)物中活 性成分的提取，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為優(yōu)化配方后的茄尼醇印跡聚合物（MIP3)電鏡圖。由圖可知茄尼醇印跡聚 合物和非印跡聚合物都具有良好的球形度，粒徑范圍為250-350 μ m，并且印跡聚合物表面 比非印跡聚合物粗糙。
[0015] 圖2圖為茄尼醇分子印跡制備色譜色譜條件優(yōu)化，其中a)圖為上樣流速對吸附率 的影響。b)圖為洗脫流速對洗脫率的影響，從中分別可知最佳上樣流速及洗脫流速。圖c) 為洗脫溶劑對洗脫率的影響，從中可知最佳洗脫溶劑比例。
[0016] 圖3a)圖為茄尼醇分子印跡制備色譜，用于分離煙葉粗提物時的制備色譜圖。其 中虛線為甲苯測量該制備色譜上樣死時間；實線部分為煙葉粗提物的制備色譜圖，第一個 峰為其過載峰；第二個平臺為茄尼醇溶液的洗脫峰。
[0017] 圖3b)為實驗中洗脫液、過載液、茄尼醇標(biāo)品和煙葉粗提液的液相色譜圖。由圖可 知，煙葉粗提液成分復(fù)雜，在茄尼醇附近存在干擾，而本實驗建立的方法可從中分離得到高 純度的茄尼醇。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過一些實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不只限于下面的例子。
[0019] (1)茄尼醇液相色譜條件確定
[0020] 茄尼醇高效液相色譜條件：色譜柱及型號卩1^1'0311^ 300-5-〇8- SH(4. 6X250mm，5ym);流動相為甲醇/水（98/2，v/v);流速為lml/min，柱溫為25°C;進(jìn)樣 量為10 μ 1 ;紫外檢測波長為210nm。配制濃度分別為0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、l、2mM的茄尼醇 甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用以上色譜條件進(jìn)行高效液相色譜（見說明書附圖3b)檢測，以濃度對應(yīng)的 峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 3X106x+104731，線性相關(guān)系數(shù)R2= 0. 9988,在此0. 01-2. OmM 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
[0021] (2)茄尼醇印跡聚合物的制備
[0022] 為制備得到球形度良好的印跡聚合物，茄尼醇分子印跡聚合物的制備采用懸浮聚 合，過程分為有機(jī)相和水相的制備。經(jīng)過試驗配方優(yōu)化（優(yōu)化方案見表1)，MlPj^制備步 驟如下，將模板、單體、交聯(lián)劑在有機(jī)溶劑中混勻超聲溶解，再加入引發(fā)劑超聲溶解，通入惰 性氣體排除液體中的空氣；水相的制備：將表面活性劑溶解到超純水中，并通入惰性氣體 排除液體中的空氣。兩相制備完畢后，將有機(jī)相在機(jī)械攪拌下，緩慢滴加到水相中，在惰性 氣體保護(hù)的條件下一定溫度下聚合，反應(yīng)結(jié)束后過濾得到印跡因子為3. 9的茄尼醇印跡聚 合物。非印跡聚合物（Nonimprinted Polymers, NIPs)的制備除了不加入模板分子，制備方 法同MIPs。
[0025] 表1為茄尼醇四種印跡聚合物的配方，及其在固相萃取實驗中對應(yīng)的吸附率、洗 脫率及印跡因子。由表1可知，MIP3對茄尼醇的吸附率最高，并且具有最高的印跡因子，因 此選擇MIP3為后續(xù)實驗中聚合物。
[0026] (3)茄尼醇分子印跡聚合物的吸附及形貌表征
[0027] 前尼醇MIPs的吸附表征：利用分子印跡固相萃取實驗來對前尼醇印跡及非印跡 聚合物對茄尼醇的動態(tài)吸附性能，為后續(xù)制備色譜應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。茄尼醇分子印跡聚合物 固相萃取柱的制備方法如下：將25g聚合物緊密置于固相萃取柱中，用有機(jī)溶劑活化。隨 后上樣，待樣品流干后用有機(jī)溶劑淋洗未吸附物質(zhì)，并用干燥離心管收集淋洗液，等其流干 后，用洗脫溶劑洗脫，并用干燥離心管收集洗脫液，待其流干后，將淋洗液和洗脫液在35°C 下用氮吹儀吹干，用有機(jī)溶劑定容，超聲溶解后，用高效液相色譜檢測其濃度。三組平行實 驗后，測量并計算洗脫率、吸附率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)(吸附實驗結(jié)果見附圖表1)。實驗 結(jié)果表明當(dāng)聚合物祖匕對茄尼醇的吸附率最高，并且具有最高的印跡因子，后續(xù)實驗中以 MIPs 指代 MIP3。
[0028] 茄尼醇MIPs的形貌表征：用掃描電鏡（SEM)對茄尼醇聚合物（MIP3)的形貌進(jìn)行 表征。電鏡圖（見附圖1)茄尼醇印跡聚合物和非印跡聚合物都具有良好的球形度，粒徑范 圍為250-350 μ m，并且印跡聚合物表面比非印跡聚合物粗糙。此外還對聚合物進(jìn)行了 BET 比表面積測試，測試條件如下，選擇加熱一抽真空脫氣模式，50°C脫氣60min，25°C下氮?dú)馕?附，飽和蒸汽壓為1. 1140bar。BET結(jié)果表明，茄尼醇MIPs