固定有抗原的免疫熒光載片的制備方法和由該方法制備的免疫熒光載片的制作方法
【專利摘要】制備固定有抗原的免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白固定在載片上制備蛋白芯片；將能夠特異結(jié)合靶蛋白的抗體與鏈霉親和素混合從而給抗體標(biāo)記上熒光納米顆粒；通過競(jìng)爭(zhēng)混合與抗體免疫反應(yīng)，利用熒光照相機(jī)分析，其中C反應(yīng)蛋白在載片上的固定包括：用3-氨丙基三甲氧基硅烷修飾載片來制備經(jīng)過修飾的載片；將3-氨丙基三甲氧基硅烷修飾的載片水合；利用戊二醛溶液活化修飾過的載片；將C反應(yīng)蛋白以0.01-0.5mg/ml的濃度溶解在30-70mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5-7.8)中從而制備用于固定的抗原溶液；將容納載片的培養(yǎng)皿放在點(diǎn)樣模板上，在點(diǎn)樣點(diǎn)上加1-100μl抗原溶液；和在如上制備的載片上反應(yīng)1-6小時(shí)以便固定抗原。利用所述方法制備的免疫熒光載片。
【專利說明】固定有抗原的免疫熒光載片的制備方法和由該方法制備的 免疫熒光載片
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年2月21日、申請(qǐng)?zhí)枮?01180019524.X(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/KR2011/001126)、名稱為"固定有抗原的免疫熒光載片的制備方法和由該方法制備的 免疫熒光載片"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及制備抗原固定化免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白 固定在載片上制成蛋白芯片，將能夠特異結(jié)合靶蛋白的抗體與鏈霉親和素混合給抗體標(biāo)記 上熒光納米顆粒，通過競(jìng)爭(zhēng)性混合使抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，用熒光照相機(jī)進(jìn)行檢驗(yàn)；并涉及用 所述方法制備的免疫熒光載片。

【背景技術(shù)】
[0003] 生物芯片包括多種類型的固定在固體支持物單位表面上的探針，使用這類生物芯 片時(shí)，僅需少量樣品，即可很方便地大規(guī)模進(jìn)行疾病診斷、高通量篩選（HTS)和酶活測(cè)量。
[0004] 多數(shù)將探針固定在載片上的方法包括將探針固定在用包被材料預(yù)先處理過的玻 璃載片上。已有多種表面化學(xué)材料被提議用于這些方法，例如可以使用自組單層膜（韓國(guó) 專利公開 2003-0038932)。
[0005] 這方面，作為提高被固定探針的量和維持探針活性的一個(gè)試驗(yàn)，開發(fā)建立了三維 (3D)固定方法（GillandBallesteros,TrendsinBiotechnology18:282, 2000)。這類3D 固定方法的例子有使用PackardBioscience的HydrogeP包被載片的方法、使用Biocept Company的基于聚乙二醇的水凝膠的方法和使用LGChemicalCo.，Ltd的solgel的方法 等。
[0006] 用于免疫傳感器的載片選自玻璃、硅、水凝膠、金屬、陶瓷和多孔膜。
[0007] 當(dāng)前，根據(jù)抗原或抗體的特異反應(yīng)性，通過將抗體或抗原固定在基片上制成的抗 體或抗原探針板被廣泛用于檢測(cè)。這類應(yīng)用中有代表性的試劑盒是快速檢驗(yàn)試劑盒、常規(guī) 檢驗(yàn)試劑盒和生物芯片試劑盒。
[0008] 這些試劑盒被用于檢測(cè)固定化抗體探針或抗原探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)的靶抗原或靶抗體。
[0009] 某些情況中，多種反應(yīng)基團(tuán)被組裝到單個(gè)探針板上，這些反應(yīng)基團(tuán)中的每一個(gè)包 括用于檢測(cè)抗原或抗體的測(cè)試條。
[0010] 同時(shí)，隨著HealthFunctionalFoodAct的生效，即使在韓國(guó)也有可能制造基于 天然材料的食物物料和加工食品，并且獲得認(rèn)可是健康功能性食品。然而，為了做到這一 點(diǎn)，需要提供材料從技術(shù)上證明健康功能性食品的功能，例如預(yù)防心血管疾病、防衰老、預(yù) 防癌癥、預(yù)防肥胖、調(diào)節(jié)免疫功能或者預(yù)防胃腸道相關(guān)疾病。相應(yīng)地，食品功能評(píng)估變得更 重要，因此功能評(píng)估有更高的商業(yè)化價(jià)值。
[0011] 食品功能評(píng)估包括根據(jù)那六種功能類型進(jìn)行的體外功能評(píng)估、用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（比如 大鼠）進(jìn)行的體內(nèi)功能評(píng)估和臨床試驗(yàn)。就食品工業(yè)來說，對(duì)開發(fā)體內(nèi)功能檢測(cè)技術(shù)的需 求增加，所述檢測(cè)技術(shù)可以利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物快速有效地對(duì)食物物料和功能性食品進(jìn)行功能評(píng) 估。
[0012] 要被認(rèn)可為功能性食品，需要具有科學(xué)上證實(shí)的目標(biāo)功能，比如心血管功能，食品 功能評(píng)估的重要性如何強(qiáng)調(diào)都不為過（Kim et al·，Detecting C-reactive protein by using direct binding quartz crystal microbalance immunosensor, Journal of The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering，Vol. 22, p. 443, 2007) 〇 傳統(tǒng) 上，在臨床試驗(yàn)前使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行的體內(nèi)功能評(píng)估是為了評(píng)估身體因素，比如體重、血壓 和器官狀況的變化。但是，這種方法產(chǎn)生的結(jié)果不一致，而且要求評(píng)估方案的變化性，技術(shù) 高超的專業(yè)人員和高成本的檢測(cè)儀器。統(tǒng)一的體內(nèi)食品功能評(píng)估方法是測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（比 如大鼠）中與特定疾病或代謝癥狀相關(guān)的特定生物標(biāo)記物的增加或減少。從這方面，含有 希望被認(rèn)可為功能性食品的食品被給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0013] 韓國(guó)專利10-921237公開的一種快速檢測(cè)食物物料和功能性食品 的心血管功能方法是通過利用石英晶體微天平型免疫傳感器高靈敏度檢 測(cè) C-反應(yīng)蛋白的方法（Biosensors and Bioelectronics, Vol. 19,P. 1193， 2004 ； Cl ini cal Chemistry,Vol.47,p. 403, 2001 ；New England Journal of Medicine，Vol. 340, p. 448, 1999 ;Biochemical Journal，Vol. 327, p. 425, 1997)，其中所述 c-反應(yīng)蛋白是一種已知是冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓等的主要生物標(biāo)記物的五聚體蛋白，其由 白介素-6和白介素-1β誘導(dǎo)刺激在哺乳動(dòng)物肝臟內(nèi)合成，具有大約118千道爾頓（kDa) 的分子量。
[0014] 與檢測(cè)C反應(yīng)蛋白的酶聯(lián)免疫分析法（ELISA) (American Journal of C ardiology,Vol. I,p. 155, 2005 ；American Journal of Veterinary Research, Vol. 1，p. 62，2005 ； J o u r n a I of Clinical Laboratory AnalySis，V〇l. 18，p. 280,2004)相比，該方法易于使用，測(cè)量不需被著色物質(zhì)干擾，并且比 其他典型傳感器測(cè)量方法有更好或等同的測(cè)量靈敏度（Biosensors and Bioelectronics， Vol. 22, p. 973, 2007 ；Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1987, 2006 ；Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1631, 2006 ；Biosensors and Bioelectronics，Vol. 21，p. 1141, 2006 ；Analytical Biochemistry, Vol. 328, p. 210, 2004)〇
[0015] 近年，使用生物傳感器的傳感器測(cè)量方法更常使用的是納米材料，比如金屬膠體、 納米碳管、熒光二氧化硅納米顆粒或半導(dǎo)體量子點(diǎn)，這類納米材料的使用促使傳感器信 號(hào)有更高的靈敏度、穩(wěn)定性或選擇性（Analytical Chemistry，Vol. 79, p. 630-707, 2007 ; Biosensors and Bioelectronics, Vol. 21, p. 1900, 2006 ；Langmuir, Vol. 22, p. 4357, 2006 ； Nano Letters,Vol. 5,p. 113, 2005 ；Biosensors and Bioelectronics,Vol.20,p.2454 ,2005 ；Proceedings of the National Academy of Sciences,Vol. 100, p. 4984, 2003 ； Biochemical and Biophysical Research Communications，Vol. 274,p.817,2000)〇
[0016] 當(dāng)使用生物傳感器通過測(cè)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中存在的作為生物標(biāo)記物的C反應(yīng)蛋 白來評(píng)估體內(nèi)心血管功能時(shí)，傳感器靈敏度的提高仍是一個(gè)關(guān)鍵問題，人們不斷地追求便 于操作的測(cè)量方法。
[0017] 發(fā)明詳述
[0018] 技術(shù)問題
[0019] 本發(fā)明提供了具有高傳感器靈敏度的一次性免疫傳感器載片，所述載片在沒有諸 如生物芯片點(diǎn)樣儀或微陣列掃描儀的復(fù)雜儀器情況下，保證使用者能夠用微量移液槍將一 定體積的抗原固定在載片上來制作或測(cè)量生物芯片從而在靶蛋白與抗體和熒光納米顆粒 的結(jié)合體之間進(jìn)行免疫反應(yīng)，或者在免疫熒光載片的抗原包被位點(diǎn)處固定化抗原和包含熒 光納米探針和特定靶分子的混合物之間進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后利用熒光顯微鏡測(cè)量通過免疫 反應(yīng)特異結(jié)合在載片表面的納米探針的熒光強(qiáng)度或熒光顆粒數(shù)量，從而鑒定靶分子（比如 身體指征分子）的濃度。
[0020] 技術(shù)解決方案
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，靶蛋白（抗原）被固定在載片上，與該抗原特異結(jié)合的抗體被標(biāo)記了 熒光物質(zhì)，從標(biāo)本中收集的靶蛋白與熒光標(biāo)記抗體混合，混合物與載片上的固定化抗原位 點(diǎn)反應(yīng)，未反應(yīng)的抗體和抗原用蒸餾水洗滌，載片被放置在培養(yǎng)箱中干燥，利用熒光顯微鏡 測(cè)量熒光顆粒的熒光強(qiáng)度或數(shù)量。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，為了對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，使用了間接競(jìng)爭(zhēng)分析形式。但是，本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員很容易知道本發(fā)明還可以利用直接競(jìng)爭(zhēng)分析形式或三明治分析形式來體現(xiàn)。
[0023] 用于本發(fā)明實(shí)施方案的免疫傳感器可以選自玻璃、硅、水凝膠、金屬、陶瓷和多孔 膜，并且大小可以在20-40x70-80mm。
[0024] 雖然在本發(fā)明的實(shí)施方案中，C反應(yīng)蛋白（下文以"CRP"指代）是作為靶樣品，對(duì) 本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的本發(fā)明的方法也可以使用其他食品-功能生物標(biāo)記物，包括心 血管生物標(biāo)記物，比如LDL、纖維蛋白原、血管緊張素II或心肌肌鈣蛋白；或者生物標(biāo)記蛋 白，其與抑制衰老、預(yù)防癌癥、預(yù)防肥胖、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防胃腸道疾病有關(guān)。
[0025] C反應(yīng)蛋白抗體可以是通過利用C反應(yīng)蛋白由哺乳動(dòng)物，比如大鼠、小鼠、兔、猴或 人誘導(dǎo)制備的任何一種抗體。
[0026] 由標(biāo)本收集的樣品可以是任何一種參照溶液，其中C反應(yīng)蛋白被溶解在反應(yīng)緩沖 液中，并可以是采自血液、血清、血漿、唾液、體液和肝臟的組織提取物。
[0027] 1-5%牛血清白蛋白（BSA)液、1-5%大鼠血清白蛋白（RSA)液、1-5%人血清白蛋 白（HSA)液、1-5%小鼠血清白蛋白（MSA)液和1-5%山羊血清白蛋白（GSA)液中的任何一 種都可以作為封閉載片表面不與抗原反應(yīng)的部分的溶液。
[0028] 以下詳細(xì)描述了本發(fā)明方法的每個(gè)步驟。
[0029] 可以利用以下方法中的任一種將作為抗原的C反應(yīng)蛋白固定在載片上。
[0030] 作為第一種固定方法，抗原的固定可以利用3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS)進(jìn) 行。對(duì)于該方法，首先利用APTMS制備修飾的載片。為了進(jìn)行修飾，將載片浸泡在食人魚 (piranha)洗液（H2SO4 =H2O2 = 2:1-4:1)中至少5-15分鐘，然后用蒸餾水洗滌載片，在蒸餾 水中超聲處理3-10分鐘，用溫度85-95°C的熱水水合洗滌30-90分鐘，然后在拭凈紙上室溫 干燥20-120分鐘。將表面洗滌過的載片放置在含有溶解在丙酮中的5-15 %APTMS溶液的培 養(yǎng)皿中，室溫下反應(yīng)30-90分鐘。載片的前后面用丙酮、30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8) 和蒸餾水順序洗滌三到四次，然后將載片在容有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。載片放在 拭凈紙上室溫干燥20-120分鐘，在對(duì)流式烤箱中以30-150°C的溫度加熱處理3-7小時(shí)，放 置冷卻，然后以干燥態(tài)保存在干燥器中待用。
[0031] 將APTMS修飾過的載片浸泡在蒸餾水中10-20分鐘進(jìn)行水合。浸泡過的載片放置 在容有1-4%戊二醛溶液的培養(yǎng)皿中，反應(yīng)30-90分鐘從而活化載片，使蛋白能夠結(jié)合到載 片表面上。經(jīng)過活化的載片前后表面用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6.5-7.8)洗滌三到四 次。然后將載片在裝有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。從燒杯中取出載片，放置在拭凈紙 上，室溫干燥20-120分鐘。
[0032] 以上使用的戊二醛是將1-41111 30-70%戊二醛加入46-491111蒸餾水中制備的，所 制溶液使用了 30-70ml。
[0033] 為了固定靶蛋白，例如C反應(yīng)蛋白，首先將0.01-0. 5mg/mlC反應(yīng)蛋白溶解在 30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7.8)中，制備用于固定的抗原溶液。裝有戊二醛活化載片 的培養(yǎng)皿放在具有格子構(gòu)型的點(diǎn)樣模板上，用1-100μ1先前制備的抗原溶液在載片上對(duì) 應(yīng)點(diǎn)樣模板上樣點(diǎn)的部分進(jìn)行點(diǎn)樣，然后給得到的結(jié)構(gòu)蓋上蓋片，反應(yīng)進(jìn)行1-6小時(shí)來固 定抗原。然后，載片的前后表面用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)洗滌三到四次，然 后在含有蒸餾水的燒杯中浸泡1分鐘。為了將戊二醛活化載片表面中要固定抗原的那部分 (不與抗原在表面上反應(yīng)的那部分）封閉，將載片放在小塑料培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)皿含有溶 于30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)的1-5%BSA溶液，然后，給得到的結(jié)構(gòu)蓋上蓋片， 反應(yīng)進(jìn)行1-5小時(shí)，待反應(yīng)停止，用BSA封閉過的載片前后表面用30-70mM磷酸鹽緩沖液 (pH6. 5-7. 8)洗滌三到四次，然后在裝有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。將載片放置在拭 凈紙上，室溫干燥20-120分鐘。
[0034] 作為第二種固定方法，抗原的固定化可以利用3-巰基丙基三甲氧基硅 烷-N-γ-馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰胺酯（MPTMS-GMBS)進(jìn)行。首先，為了清潔表面，將 載片在含有濃鹽酸（18-36% )和甲醇（50-100% )的混合液（HCl:MtOH= 1:1-1:2,體積 比）中浸泡15-45分鐘，然后載片前后表面用蒸餾水洗滌三到四次。載片用85-95°C蒸餾水 洗滌后，放置在拭凈紙上，室溫干燥20-120分鐘。
[0035] 為了將這樣得到的載片硅烷化，制備50-500mlMPTMS溶液，其中在選自甲苯、二甲 基甲酰胺和丙酮的有機(jī)溶劑液中溶解了 1-3%的MPTMS。將載片放在容有所述溶液的培養(yǎng) 皿中，室溫反應(yīng)1-3小時(shí)。載片前后表面用制備MPTMS溶液使用的相同有機(jī)溶劑洗滌三到 四次，然后將載片放置在拭凈紙上，室溫干燥20-120分鐘。
[0036] 為了活化載片表面，如下所述制備l_3mMGMBS溶液。將14-42mgGMBS樣品溶解 在ΙΟΟμΙN，N-二甲基甲酰胺（DMF;Sigma-AldrichCompany，USA)中，然后，向其中加入 49. 9ml乙醇。經(jīng)過硅烷化的載片被放在容有GMBS溶液的培養(yǎng)皿中，室溫下反應(yīng)30-90分 鐘。載片前后表面用蒸餾水和30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7.8)洗滌三到四次。然后將 載片放置在拭凈紙上，室溫干燥20-120分鐘。
[0037] 按照以下方式將CRP抗原固定。首先，將C反應(yīng)蛋白以0. 01-0. 5mg/ml的濃度溶解 在30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)中，制備用于固定化的抗原溶液。將容有GMBS活化 載片的培養(yǎng)皿放在點(diǎn)樣模板上，然后用1-1〇〇μ1先前制備的抗原溶液在載片上對(duì)應(yīng)點(diǎn)樣 模板上樣點(diǎn)的部分進(jìn)行點(diǎn)樣，然后給得到的結(jié)構(gòu)蓋上蓋片，反應(yīng)進(jìn)行1-6小時(shí)來固定抗原。 然后，載片的前后表面用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7.8)洗滌三到四次，載片在裝有 蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘。為了提高分析的準(zhǔn)確性，將載片放在容有1-5%BSA溶液 的小塑料培養(yǎng)皿中，得到的結(jié)構(gòu)蓋上蓋片，進(jìn)行反應(yīng)1-5小時(shí)。載片的前后表面用以上描述 的磷酸鹽緩沖液洗滌三到四次。然后將載片在盛有蒸餾水的燒杯中浸泡1-60分鐘，之后置 于拭凈紙上，室溫干燥20-120分鐘。
[0038] 圖1中示意了這兩種方法。
[0039] 為了用本發(fā)明免疫傳感器載片來分析具體蛋白質(zhì)，對(duì)與載片上所固定的抗原特異 結(jié)合的抗體進(jìn)行標(biāo)記?？贵w的標(biāo)記可以利用靈敏度和重復(fù)性高的熒光染色法進(jìn)行，為此，根 據(jù)本發(fā)明使用了熒光二氧化硅納米顆粒（下文以"FSNP"指代）。
[0040] 以下簡(jiǎn)要描述了制備FSNP的方法。用于對(duì)特異結(jié)合抗原的抗體進(jìn)行標(biāo)記的FSNP 可以利用下述方法來制備，所述方法是染料捕獲法（其中在二氧化硅結(jié)構(gòu)中包含有機(jī)熒光 色素）、核殼法（其中活性有機(jī)熒光色素與氨基硅烷化合物共價(jià)結(jié)合，得到的結(jié)構(gòu)包含在二 氧化硅結(jié)構(gòu)中）、或者反轉(zhuǎn)的核殼法（其中二氧化硅結(jié)構(gòu)包含了有機(jī)熒光色素，形成的顆粒 與有機(jī)硅烷化合物反應(yīng)從而引入官能團(tuán)獲得功能性）。這方面來說，這類有機(jī)熒光色素的例 子是二氯三（1，10-鄰二氮雜菲）釕（II)水合物、熒光素、羅丹明B和5(6)-羧基四甲基羅 丹明；活性有機(jī)熒光色素的例子是異硫氰酸熒光素、5 (6)-羧基四甲基羅丹明N-琥珀酰亞 胺酯、四甲基羅丹明5-異硫氰酸酯、雙（2, 2' -聯(lián)吡啶）-4' -甲基-4-羰基聯(lián)吡啶釕-N-琥 珀酰亞胺酯雙（六氟磷酸酯）和雙（2, 2' -聯(lián)吡啶）-4, 4' -二羧基聯(lián)吡啶釕雙（N-琥珀酰亞 胺酯）雙（六氟磷酸酯）、氨基硅烷化合物的例子是（3-氨丙基）三乙氧基硅烷、有機(jī)硅烷 化合物的例子是包含羧酸酯、胺基、胺基/膦酸酯、聚（乙二醇）和十八烷基、羧酸根/十八 烷基諸官能團(tuán)的化合物。
[0041] 以下描述了用FSNP標(biāo)記抗體的方法。首先，需要用與生物素特異結(jié)合的鏈霉親和 素（SA)對(duì)FSNP進(jìn)行修飾。進(jìn)行該修飾使結(jié)合有SA的FSNP(下文另有描述）與生物素化 的抗體結(jié)合。要用SA修飾FSNP，首先將FSNP與（3-巰基丙基）三甲氧基硅烷（MPTMS)反 應(yīng)，制備巰基修飾的FSNP。將l-5mgFSNP和5-15ml醇（比如乙醇、甲醇或丙醇）加入容 量10-70ml的帶蓋試管中，充分搖勻混合液，然后超聲處理10-30分鐘使FSNP完全溶于醇。 隨后，向該試管中加入30-70到200μIMPTMS，將所得混合液在室溫下以30-200rpm的低速 攪拌，反應(yīng)2-6小時(shí)。反應(yīng)混合液在3-KTC的溫度下以7000-17000rpm的速度離心20-40 分鐘，將得到的沉淀物用反應(yīng)中使用的同樣的醇洗一到五次，每次洗滌后，按照以上描述的 條件離心，獲得沉淀物。從試管上取下蓋子，用鋁箔輕輕覆蓋試管，室溫下干燥。沉淀物溶 于2-6ml30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)中，制得巰基修飾的FSNP溶液。
[0042] 向巰基修飾的FSNP中加入經(jīng)馬來酰亞胺活化的SA來制備結(jié)合有SA的FSNP。具 體來說，將0. 1-0. 5mgSA-馬來酰亞胺溶解在容量10-70ml的帶蓋試管中的3-7ml30-70mM 磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)中，制備SA-馬來酰亞胺溶液。然后，向其中加入0.5-2.Oml 巰基修飾的FSNP溶液，將混合液以30-200rpm的低速持續(xù)攪拌，室溫下反應(yīng)1-3小時(shí)。反 應(yīng)產(chǎn)物在3-10°C的溫度下以7000-17000rpm的速度離心20-40分鐘，得到沉淀物。沉淀物 用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)洗一到五次，每次洗滌后，按照以上描述的同樣的 條件進(jìn)行離心，獲得沉淀物。將沉淀物用l_5ml30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7.8)重懸。 懸浮液加入帶蓋試管中，用鋁箔包裹冷藏，與下文描述的生物素化抗體反應(yīng)。
[0043] C反應(yīng)蛋白抗體的生物素化可以利用下述方法之一進(jìn)行。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的C反應(yīng)蛋白抗體的生物素化方法包括：給C反應(yīng)蛋白抗體 加入碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，得到含有C反應(yīng)蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液；將生 物素氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS-LC-生物素）溶液與碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液 反應(yīng)，前一種溶液是溶解在有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺中的生物素化試劑；并將獲得的溶液在 氯化鈉溶液中透析以便除去未反應(yīng)的生物素化試劑。
[0045] 具體來說，生物素化方法包括給C反應(yīng)蛋白抗體添加碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖 液，得到含有1.0-3. 〇mg/mlC反應(yīng)蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，取30-100μ1 NHS-LC-生物素溶液（溶解在二甲基甲酰胺中的l-5mg/mlNHS-LC-生物素）與25-75μ1 碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液在冰水中反應(yīng)1-5小時(shí)，將75-175μ1得到的溶液在0. 1-0. 3Μ氯 化鈉溶液中透析過夜，除去未反應(yīng)的生物素化試劑。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方案的C反應(yīng)蛋白抗體生物素化方法包括：給C反應(yīng)蛋白 抗體添加磷酸鹽緩沖液，制備含有C反應(yīng)蛋白抗體的磷酸鹽緩沖液，將磺基琥珀酰亞氨 基-6-(生物素酰胺）己酸酯（磺基-NHS-LC-生物素）溶液（溶于重蒸水的水溶性生物素 化試劑）與磷酸鹽緩沖液反應(yīng)，將得到的溶液在磷酸鹽緩沖液中透析以除去未反應(yīng)的生物 素化試劑。
[0047] 具體來說，根據(jù)該實(shí)施方案的生物素化方法包括給C反應(yīng)蛋白抗體加入磷酸鹽 緩沖液，制備C反應(yīng)蛋白抗體濃度在0. 5-3.0mg/ml范圍的磷酸鹽緩沖液，取5-20μ1磺 基-NHS-LC-生物素溶液（其中2-20mM磺基-NHS-LC-生物素溶于重蒸水）與30-800μ1 磷酸鹽緩沖液在冰水中反應(yīng)1-5小時(shí)，將得到的溶液取55-820μ1在0. 05-0. 25Μ磷酸鹽緩 沖液中過夜透析，除去未反應(yīng)的生物素化試劑。
[0048] 接下來，制備結(jié)合有納米材料的抗體。當(dāng)SA修飾的FSNP與生物素化抗體被混合 時(shí)，由于生物素和SA之間的特異結(jié)合，就制得標(biāo)記了熒光材料的抗體。
[0049] 具體來說，將SA修飾的FSNP溶液超聲處理10-30分鐘，然后將200-600μ1所得 溶液加入l_3ml0. 05-0. 25mg/ml生物素化抗體溶液中。一方面混合液以30分鐘的間隔于 30-200rpm的低速攪拌2-7分鐘，一方面使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1-3小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在3-10°C 的溫度以7000-17000rpm的速率離心20-40分鐘，棄去上清液，采用沉淀物。用30-70mM磷 酸鹽緩沖液（pH6.5-7.8)將沉淀物洗一到五次，每次洗滌后，在和以上描述的相同條件下 離心，使用所得沉淀物。將沉淀物重懸于0.4-1. 2ml30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7.8) 中。
[0050] 圖2闡述了根據(jù)本發(fā)明，用熒光材料對(duì)特異結(jié)合CRP的抗體進(jìn)行標(biāo)記的示意性方 法。
[0051] 利用本發(fā)明的免疫傳感器載片對(duì)具體蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，將由樣本獲得的靶蛋 白與標(biāo)記抗體混合。
[0052] 具體來說，用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)在Eppendorf管中制備不同濃 度的C反應(yīng)蛋白樣品液，并向各濃度的C反應(yīng)蛋白樣品溶液中加入C反應(yīng)蛋白抗體溶液，后 者是通過生物素和SA之間的特異結(jié)合制備的并且結(jié)合有作為納米材料的FSNP，其中C反應(yīng) 蛋白抗體溶液和C反應(yīng)蛋白樣品溶液的量是相同的，該混合液室溫下靜置5-300分鐘。
[0053] 然后，使混合液與固定在載片上的抗原進(jìn)行反應(yīng)。
[0054] 具體來說，將容有作為生物傳感器的載片的培養(yǎng)皿放在帶有格子結(jié)構(gòu)的點(diǎn)樣模板 上，其中所述載片上通過戊二醛方法或者M(jìn)PTMS-GMBS方法固定了C反應(yīng)蛋白作為抗原并且 通過胎牛血清白蛋白（BSA)封閉方法使非選擇性蛋白的吸附最小化；在固定有抗原的載片 位置進(jìn)行混合，然后取1-100μ1混合液（在室溫下靜置了 5-300分鐘的包含由樣本獲得的 靶蛋白和標(biāo)記抗體）準(zhǔn)確地點(diǎn)樣，給得到的結(jié)構(gòu)蓋上蓋片，反應(yīng)于室溫下進(jìn)行0. 5-16小時(shí)， 從而使固定在載片上的抗原和采集自樣本的抗FSNP標(biāo)記抗體的靶蛋白之間發(fā)生間接競(jìng)爭(zhēng) 分析。終止反應(yīng)后，通過用蒸餾水將載片前后面洗滌三到四次并將載片在含有蒸餾水的燒 杯中浸泡1-60分鐘來除去未反應(yīng)的抗體和抗原。
[0055] 圖3描述的是解釋固定在載片上的抗原如何通過間接競(jìng)爭(zhēng)分析結(jié)合熒光標(biāo)記抗 體的示意圖，圖4顯示了用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7.8)代替采集自樣本的C反 應(yīng)蛋白與如上所述的標(biāo)記抗體混合，然后將混合液點(diǎn)樣在固定在載片上的抗原上進(jìn)行抗 原-抗體反應(yīng)時(shí)，結(jié)合在載片上的熒光顆粒數(shù)量隨時(shí)間的變化圖。
[0056] 載片在培養(yǎng)箱中干燥20-120分鐘。
[0057] 利用熒光顯微鏡測(cè)量熒光強(qiáng)度和熒光顆粒的數(shù)量。當(dāng)樣品中CRP的濃度高時(shí)，更 多的CRP與熒光標(biāo)記抗體反應(yīng)。相應(yīng)地，更少熒光標(biāo)記抗體與載片上固定的抗原結(jié)合，因此 熒光強(qiáng)度和熒光顆粒的數(shù)量下降。正如以上描述的，載片上固定的抗原和由樣本獲得的抗 原競(jìng)爭(zhēng)與熒光標(biāo)記抗體相互作用，從而顯示出不同的熒光強(qiáng)度水平。因此，可以在相對(duì)短的 時(shí)間內(nèi)容易地測(cè)量CRP。
[0058] 有益的效果
[0059] 本發(fā)明提供了免疫傳感器載片，所述載片通過將C反應(yīng)蛋白包被在載片上、并且 使C反應(yīng)蛋白與結(jié)合了熒光納米探針的抗體反應(yīng)，在納摩爾水平上進(jìn)行評(píng)估，以此來高度 靈敏地簡(jiǎn)易測(cè)量作為體內(nèi)食品功能指示物的生物標(biāo)記物，其中所述C反應(yīng)蛋白已知是冠狀 動(dòng)脈疾病、高血壓和炎癥的主要生物標(biāo)記物。
[0060] 本發(fā)明可以為將來超級(jí)靈敏地快速同時(shí)測(cè)量例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中以較寬濃度范 圍存在的生物標(biāo)記物（除了C反應(yīng)蛋白以外，還比如低密度脂蛋白（LDL)、纖維蛋白原或者 血管緊張素II)建立所需的與食品功能評(píng)估相關(guān)的基礎(chǔ)技術(shù)。
[0061] 本發(fā)明還涉及以下方面：
[0062]項(xiàng)1.制備固定有抗原的免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白固定 在載片上制備蛋白芯片；用熒光納米顆粒標(biāo)記能夠特異結(jié)合C反應(yīng)蛋白的抗體；將由標(biāo)本 獲得的靶蛋白與熒光標(biāo)記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應(yīng)；以及通過利用熒 光顯微鏡測(cè)量熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量進(jìn)行分析，
[0063] 其中C反應(yīng)蛋白在載片上的固定包括：
[0064] 用3-氨丙基三甲氧基硅烷修飾載片來制備經(jīng)過修飾的載片；
[0065] 將3-氨丙基三甲氧基硅烷修飾的載片水合；
[0066] 利用戊二醛溶液活化修飾過的載片；
[0067] 將靶蛋白以0· 01-0. 5mg/ml的濃度溶解在30-70mM磷酸鹽緩沖液（ρΗ6· 5-7. 8)中 從而制備用于固定的抗原溶液；
[0068] 將包含載片的培養(yǎng)皿放在點(diǎn)樣模板上，在各個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)上加1-100μ1抗原溶液；和
[0069] 在如上制備的載片上反應(yīng)1-6小時(shí)以便固定抗原。
[0070]項(xiàng)2.制備固定有抗原的免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白固定 在載片上制備蛋白芯片；用熒光納米顆粒標(biāo)記能夠特異結(jié)合C反應(yīng)蛋白的抗體；將由標(biāo)本 獲得的靶蛋白與熒光標(biāo)記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應(yīng)；以及通過利用熒 光顯微鏡測(cè)量熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量進(jìn)行分析，
[0071] 其中C反應(yīng)蛋白在載片上的固定包括：
[0072] 通過將載片在包含濃鹽酸和甲醇的混合液（HC1:MtOH= 1:1-1:2,體積比）中浸泡 15-45分鐘來洗滌載片；
[0073] 對(duì)載片進(jìn)行娃燒化，方法是，制備3_疏基丙基二甲氧基娃燒溶液，其中將1_3 % 的3-巰基丙基三甲氧基硅烷溶液溶于選自甲苯和二甲基甲酰胺的有機(jī)溶劑中，用與制備 3_巰基丙基三甲氧基硅烷溶液所用的相同的有機(jī)溶劑將載片的前表面和后表面洗三到四 次；
[0074] 用l_3mMN-Y馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰亞胺酯溶液活化載片表面；
[0075] 將0· 01-0. 5mg/ml的C反應(yīng)蛋白溶解在30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)中 從而制備用于固定的抗原溶液；
[0076] 將含有載片的培養(yǎng)皿放在點(diǎn)樣模板上，在各個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)上加1-100μ1抗原溶液；和
[0077] 在如上制備的載片上反應(yīng)1-6小時(shí)以便固定抗原。
[0078] 項(xiàng)3.制備固定有抗原的免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白固定 在載片上制備蛋白芯片；用熒光納米顆粒標(biāo)記能夠特異結(jié)合C反應(yīng)蛋白的抗體；將由標(biāo)本 獲得的靶蛋白與熒光標(biāo)記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應(yīng)，以及通過利用熒 光顯微鏡測(cè)量熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量進(jìn)行分析，
[0079] 其中用熒光納米顆粒對(duì)抗體進(jìn)行的標(biāo)記包括：
[0080] 將3-巰基丙基三甲氧基硅烷與熒光二氧化硅納米顆粒反應(yīng)從而制備巰基修飾的 熒光二氧化硅納米顆粒；
[0081] 向巰基修飾的熒光二氧化硅納米顆粒加入經(jīng)馬來酰亞胺活化的鏈霉親和素來制 備結(jié)合有鏈霉親和素的熒光二氧化硅納米顆粒；
[0082] 將C反應(yīng)蛋白抗體生物素化；和
[0083] 將鏈霉親和素修飾的熒光二氧化硅納米顆粒與生物素化抗體混合，制備標(biāo)記有熒 光材料的抗體。
[0084] 項(xiàng)4.項(xiàng)3所述的方法，其中C反應(yīng)蛋白抗體的生物素化包括：
[0085] 給C反應(yīng)蛋白抗體加入碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液，得到包含C反應(yīng)蛋白抗體的碳 酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液；
[0086] 將溶于二甲基甲酰胺中作為生物素化試劑的生物素氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺 酯（NHS-LC-生物素）溶液與包含C反應(yīng)蛋白抗體的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液反應(yīng)；和[0087] 將反應(yīng)溶液在氯化鈉溶液中透析以便除去未反應(yīng)的生物素化試劑。
[0088] 項(xiàng)5.項(xiàng)3所述的方法，其中C反應(yīng)蛋白抗體的生物素化包括：
[0089] 給C反應(yīng)蛋白抗體添加磷酸鹽緩沖液以獲得包含C反應(yīng)蛋白抗體的磷酸鹽緩沖 液；
[0090] 將溶于重蒸水中作為水溶性生物素化試劑的磺基琥珀酰亞氨基-6-(生物素酰胺 基）己酸酯（磺基-NHS-LC-生物素）溶液與包含C反應(yīng)蛋白抗體的磷酸鹽緩沖液反應(yīng)；和
[0091] 將反應(yīng)溶液在磷酸鹽緩沖液中透析以除去未反應(yīng)的生物素化試劑。
[0092] 項(xiàng)6.制備固定有抗原的免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白固定 在載片上制備蛋白芯片；用熒光納米顆粒標(biāo)記能夠特異結(jié)合C反應(yīng)蛋白的抗體；將由標(biāo)本 獲得的靶蛋白與熒光標(biāo)記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應(yīng)，以及通過利用熒 光顯微鏡測(cè)量熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量進(jìn)行分析，
[0093] 其中用熒光納米顆粒對(duì)抗體進(jìn)行的標(biāo)記包括：
[0094] 將鏈霉親和素修飾的熒光二氧化硅納米顆粒溶液超聲處理10-30分鐘；
[0095] 取所得溶液200-600μ1加入l-3ml0· 05-0. 25mg/ml生物素化抗體溶液中，室溫 反應(yīng)1-3小時(shí)，期間以30分鐘的間隔于30-200rpm的低速進(jìn)行攪拌，每次攪拌2-7分鐘；
[0096] 反應(yīng)溶液在3-10°C的溫度下以7000-17000rpm的速率離心20-40分鐘，棄去上清 液，收集沉淀；
[0097] 用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)將沉淀物洗一到五次，每次洗滌后，在和 以上描述的相同的條件下離心，獲取沉淀物；和
[0098] 將沉淀物重懸于0· 4-L2ml30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)中。
[0099]項(xiàng)7.利用項(xiàng)1-6之一所述方法制備的免疫熒光載片，其中所述免疫熒光載片是用 3_氨丙基三甲氧基硅烷或3-巰基丙基三甲氧基硅烷-N-γ馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰 亞胺酯進(jìn)行表面修飾過的，并且包含1-100μ1 〇. 01-0. 5mg/mlC反應(yīng)蛋白。
[0100] 項(xiàng)8.利用項(xiàng)7所述的免疫熒光載片測(cè)量標(biāo)本中C反應(yīng)蛋白的方法。
[0101] 附圖描述
[0102] 圖1是解釋將C反應(yīng)蛋白固定在載片的兩種方法的不意圖。
[0103] 圖2示意用熒光材料對(duì)特異結(jié)合CRP的抗體進(jìn)行標(biāo)記的方法。
[0104] 圖3是說明熒光標(biāo)記的抗體通過間接競(jìng)爭(zhēng)與固定在載片上的抗原結(jié)合的示意圖。
[0105] 圖4顯示了用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH6. 5-7. 8)代替采集自樣本的C反應(yīng)蛋白 與如上所述的標(biāo)記抗體混合，然后將混合液點(diǎn)樣在載片上固定了抗原的地方進(jìn)行抗原-抗 體反應(yīng)時(shí)，結(jié)合在載片上的熒光顆粒數(shù)量隨時(shí)間的變化圖。
[0106] 圖5A、5B和5C顯示的圖像表明在用食人魚洗液處理前載片表面存在的污染物質(zhì) (比如雜質(zhì)）抑制點(diǎn)通過食人魚溶液處理被除去，即使在用APTMS硅烷化后，也觀察不到抑 制點(diǎn)。圖顯示用2. 5%戊二醛溶液處理的基板圖像，其中沒有觀察到抑制點(diǎn)。圖5E顯 示的圖像是抗原被固定后，載片表面用BSA封閉的部分沒有抑制點(diǎn)。圖5F顯示的圖像含有 熒光二氧化硅納米顆粒標(biāo)記的抗體的熒光點(diǎn)，所述結(jié)合在載片表面的抗體經(jīng)過間接競(jìng)爭(zhēng)反 應(yīng)。
[0107] 圖6展示了熒光檢測(cè)使用的儀器。
[0108] 圖7展不了固定有抗原的免疫突光載片和基于FSNP標(biāo)記抗體的C反應(yīng)蛋白的校 準(zhǔn)曲線圖。
[0109] 發(fā)明實(shí)施方式
[0110] 以下參照實(shí)施例對(duì)發(fā)明方法進(jìn)行了詳細(xì)描述。但是，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí) 施例。
[0111] 本試驗(yàn)中使用的材料如下所述：
[0112] 在小鼠骨髓瘤細(xì)胞系（NSO)中表達(dá)的帶有組氨酸標(biāo)簽的重組CRP(純態(tài)）購(gòu)自 R&DSystems,Inc. (Miniapolice,MN,USA),貫穿在本試驗(yàn)中使用。其同質(zhì)五聚體結(jié)構(gòu)由三 個(gè)非共價(jià)亞基和兩個(gè)共價(jià)亞基構(gòu)成。此外，由小鼠骨髓瘤和B細(xì)胞融合得到的雜交瘤所 產(chǎn)生的單克隆抗大鼠CRP抗體（來自用純化NSO誘導(dǎo)的重組大鼠CRP免疫的小鼠）購(gòu)自 R&DSystemsInc。玻璃載片購(gòu)自CoringInc. (Kennebunk,ME,USA)。水溶性生物素化試 劑（磺基琥珀酰亞氨基-6-(生物素酰胺基）己酸酯：磺基-NHS-LC-生物素）購(gòu)自Pierce Biotechnology,Inc. (Rockford,IL,USA)。3-氨丙基三甲氧基娃燒（APTMS)、戊二醒和牛血 清白蛋白（BSA)購(gòu)自Sigma-AldrichChemicalCo. (St.Louis,MO,USA)。以下試驗(yàn)中使用 的其他化合物由不同供應(yīng)商提供，試驗(yàn)過程使用雙蒸水。
[0113]實(shí)施例1 :抗原在用APTMS-GA處理討的載片h.的固定
[0114] 如下將抗原固定在載片上。即為了清潔表面，將載片在食人魚洗液（H2SO4 =H2O2 = 3:1，體積比）中浸泡10分鐘，用蒸餾水洗滌，在蒸餾水中超聲處理5分鐘，通過用溫度為 90°C的熱水雜交來洗滌1小時(shí)，放置在拭凈紙（kimwipes)上，然后室溫干燥30分鐘。
[0115] 為了進(jìn)行硅烷化從而給載片表面引入固定抗原所需要的氨基基團(tuán)（-NH2),將表面 清潔過的載片置于含有APTMS溶液（溶于丙酮的10%APTMS)的培養(yǎng)皿中，室溫反應(yīng)1小 時(shí)。載片前后面用50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.4)和蒸餾水順序洗滌各三次，然后在含有蒸 餾水的燒杯中浸泡1分鐘。取出這樣生成的載片，然后在拭凈紙上室溫干燥30分鐘，在對(duì) 流型烤箱中于120°C熱處理5小時(shí)，靜置冷卻，獲取其熒光圖像（參見圖5A、5B和5C)。如 圖5A、5B和5C所示，確認(rèn)用食人魚洗液處理前載片表面上存在的污染物質(zhì)（比如雜質(zhì)）抑 制點(diǎn)通過食人魚溶液處理已被除去，即使在用APTMS硅烷化后，也未再觀察到抑制點(diǎn)熒光 圖像。
[0116] 為了活化APTMS修飾過的載片，將載片在蒸餾水中浸泡15分鐘，取出置于含有戊 二醛2. 5%溶液的培養(yǎng)皿中，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)以便蛋白質(zhì)結(jié)合到載片表面上。將活化后載 片的前后表面用50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.4)洗滌三次，然后在含有蒸餾水的燒杯中浸泡 1分鐘。取出載片，放在拭凈紙上室溫干燥30分鐘，其熒光圖像也顯示GA活化載片表面沒 有抑制點(diǎn)（參見圖OT)。
[0117] 為了將抗原（CRP，C反應(yīng)蛋白）固定在載片上，首先將C反應(yīng)蛋白以0·lmg/ml的 濃度溶解在50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.4)中制備用于固定的抗原溶液。將含有戊二醛活化 載片的培養(yǎng)皿放在具有格子結(jié)構(gòu)的點(diǎn)樣模板上，用20μ1抗原溶液在載片上對(duì)應(yīng)點(diǎn)樣模板 上樣點(diǎn)的部分進(jìn)行點(diǎn)樣，然后給培養(yǎng)皿蓋上蓋子，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)來固定抗原。然后，載片 的前后表面用50mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)洗滌三次，在含有蒸餾水的燒杯中浸泡1分鐘。 為了將戊二醛活化后要進(jìn)行抗原固定的載片的表面上不與抗原反應(yīng)的那部分封閉，將載片 放在小塑料培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)皿含有溶于50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.4)的1%牛血清白蛋 白（BSA)溶液，然后，給培養(yǎng)皿蓋上蓋子，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。然后載片前后表面用50mM磷酸 鹽緩沖液（pH7. 4)洗滌三次，在含有蒸餾水的燒杯中浸泡1分鐘，將載片放置在拭凈紙上， 室溫干燥30分鐘，其熒光圖像也顯示抗原固定后，在BSA封閉的載片表面沒有抑制點(diǎn)（參 見圖5E)。
[0118]實(shí)施例2 :抗原在用MTS-GMBS處理討的載片h.的固定
[0119] 通過以下過程將抗原固定在載片上。即為了清潔表面，將載片在含有體積比1:1 的濃鹽酸（35%)和甲醇（70%)的混合液中浸泡30分鐘，然后載片用蒸餾水洗滌三次。在 濃硫酸中浸泡30分鐘后，載片前后表面用蒸餾水洗滌三次，用沸騰的蒸餾水洗滌，放在拭 凈紙上室溫干燥30分鐘。
[0120] 為了進(jìn)行硅烷化從而給載片表面引入固定抗原所需要的反應(yīng)基團(tuán)巰基（-SH)，將 2ml(3-巰基丙基）三甲氧基硅烷（MPTMS)加入98ml甲苯，制備2%MPTMS溶液。將載片放 在含有所述溶液的培養(yǎng)皿中，室溫反應(yīng)2小時(shí)。之后載片用甲苯洗滌三次，然后放在拭凈紙 上，室溫干燥30分鐘。
[0121] 為了活化經(jīng)MPTMS修飾的載片，將28mgGMBS溶于100μIN，N-二甲基甲酰胺 (DMF,ChromosllvijiPlus,St.LouisMO,USA,HPLC彡"· 9% )中，并向其中加入 49·9ml 乙醇來制備2mMGMBS溶液。經(jīng)過硅烷化的載片被置于含有2mMGMBS溶液的培養(yǎng)皿中，室 溫反應(yīng)1小時(shí)。載片的前后表面用蒸餾水和50mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)洗滌三次，放在拭 凈紙上室溫干燥30分鐘。
[0122] 為了將抗原（CRP，C反應(yīng)蛋白）固定在載片上，首先，將0.lmg/mlC反應(yīng)蛋白溶 解在50mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)中，制備用于固定化的抗原溶液。將含有GMBS活化載片 的培養(yǎng)皿放在點(diǎn)樣模板上，用20μ1抗原溶液在載片上對(duì)應(yīng)點(diǎn)樣模板上樣點(diǎn)的部分進(jìn)行點(diǎn) 樣，然后給培養(yǎng)皿蓋上蓋子，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)來固定抗原。然后，載片的前后表面用50mM磷 酸鹽緩沖液（PH7. 4)洗滌三次，在含有蒸餾水的燒杯中浸泡1分鐘。為了將GMBS活化后要 進(jìn)行抗原固定的載片的表面上不與抗原反應(yīng)的那部分封閉，將載片放在小塑料培養(yǎng)皿中， 所述培養(yǎng)皿含有溶于50mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)的1 %牛血清白蛋白（BSA)溶液，給培養(yǎng) 皿蓋上蓋子，反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。然后載片前后表面用50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.4)洗滌三 次，載片在含有蒸餾水的燒杯中浸泡1分鐘，放在拭凈紙上，室溫干燥30分鐘。
[0123] 在將抗原固定到MTS-GMBS處理過的載片的過程中的各個(gè)相應(yīng)步驟（即表面清潔、 硅烷化、活化、抗原固定和BSA封閉）獲取載片的熒光圖像。結(jié)果證實(shí)所有熒光圖像中都沒 有顯示會(huì)抑制傳感器在載片表面進(jìn)行的測(cè)量的抑制點(diǎn)，除了用含有濃鹽酸和甲醇（1: 1，體 積比）的混合液處理前的載片之外。
[0124]實(shí)施例3 :SA修飾的FSNP的制各
[0125] 將2mgFSNP和IOml乙醇加入容量為25ml的帶蓋試管中，混合液充分搖勻，然后 超聲處理15分鐘使FSNP完全溶于乙醇。隨后，向該試管中加入100μIMPTMS，室溫下以 IOOrpm的低速攪拌，反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)混合液在4°C的溫度下以13000rpm的速度離心30 分鐘，將得到的沉淀物用乙醇洗三次，每次洗滌后，按照以上描述的同樣條件離心獲得沉淀 物。從試管上取下蓋子，用鋁箔輕輕覆蓋試管，室溫下干燥。每份沉淀物溶解在4ml50mM 磷酸鹽緩沖液（pH7.4)中，制備巰基修飾的FSNP溶液。
[0126] 將0. 25mg SA-馬來酰亞胺和5ml 50mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)加入容量25ml的 帶蓋試管中，使SA-馬來酰亞胺溶解，制備SA-馬來酰亞胺溶液。然后，向其中加入Iml巰 基修飾的FSNP溶液，將混合液以IOOrpm的低速持續(xù)攪拌，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物在 4°C的溫度下以IOOOOrpm的速度離心20分鐘得到沉淀物。沉淀物用50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.4)洗三次，每次洗滌后，按照以上描述的同樣條件進(jìn)行離心。將沉淀物重懸在2ml 50mM 磷酸鹽緩沖液（pH7.4)中。得到的產(chǎn)物加入帶蓋試管中，用鋁箔包裹冷藏，與下文描述的 生物素化抗體反應(yīng)。
[0127]實(shí)施例4 :抗體的牛物素化
[0128] 將冷藏的Img管的水溶性生物素化試劑磺基琥珀酰亞氨基-6-(生物素酰胺基） 己酸酯（磺基-NHS-LC-生物素）轉(zhuǎn)移到室溫條件，取30-700μ1 0.IM磷酸鹽緩沖液（pH 7. 2)溶于30-700μg管單克隆抗大鼠CRP抗體。給Img管磺基-NHS-LC-生物素加入180μ1 蒸餾水，制備IOmM磺基-NHS-LC-生物素溶液，然后取6. 67μ1混合液加入抗體溶液，將生 物素對(duì)抗體的分子比率控制在20:1。將含有反應(yīng)液的小管輕柔震蕩，然后放在Eppendorf 管架上，置于冰水中反應(yīng)2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合液加樣到slide-A-lyzer試劑盒（Pierce Biotechnology,Inc)中，對(duì)0.IM磷酸鹽緩沖液（pH7. 2)透析過夜，除去未反應(yīng)的試劑并回 收透析膜內(nèi)存留的透析液，然后利用和制備生物素化抗體使用的相同磷酸鹽緩沖液將透析 液總體積控制在lml。
[0129] 實(shí)施例5 :結(jié)合納米材料的抗體的制各
[0130] 將SA修飾的FSNP溶液超聲處理15分鐘，然后取400μ1得到的溶液加入2ml 0.lmg/ml生物素化抗體溶液中，一方面以30分鐘的間隔于IOOrpm的低速進(jìn)行攪拌，每次攪 拌5分鐘，一方面使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。將反應(yīng)產(chǎn)物在4°C的溫度以IOOOOrpm的速 率離心20分鐘，棄去上清液，收集沉淀物。用50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.4)將沉淀物洗三 次，每次洗滌后，在和以上描述的相同條件下離心獲得沉淀物。將沉淀物重懸于〇. 8ml50mM 磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)中。
[0131] 實(shí)施例6 :樣本溶液和標(biāo)記抗體的混合
[0132] 向不同濃度的C反應(yīng)蛋白樣品溶液中加入C反應(yīng)蛋白抗體溶液，其中所述C反 應(yīng)蛋白抗體溶液是基于生物素和SA之間的特異結(jié)合制備的并且結(jié)合有作為納米材料的 FSNP，所述C反應(yīng)蛋白樣品溶液是用Eppendorf管中的50mM磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)稀釋而 制備的，其中C反應(yīng)蛋白抗體溶液和C反應(yīng)蛋白樣品溶液的量是相同的，將這些溶液混合， 室溫下反應(yīng)1小時(shí)。
[0133] 實(shí)施例7 :間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)
[0134] 將含有作為生物傳感器的載片的培養(yǎng)皿放在帶有格子結(jié)構(gòu)的點(diǎn)樣模板上，其中根 據(jù)實(shí)施例1和2所述載片上固定了作為抗原的C反應(yīng)蛋白并且通過BSA封閉過程使非選擇 性蛋白的吸附最小化；在固定有抗原的載片位置進(jìn)行混合，然后取20μ1包含從標(biāo)本采集 的靶蛋白并且在室溫靜置了 1小時(shí)的混合液準(zhǔn)確地點(diǎn)樣，將得到的結(jié)構(gòu)蓋上，反應(yīng)于室溫 下進(jìn)行2小時(shí)，從而使固定在載片上的抗原和采集自標(biāo)本的抗FSNP標(biāo)記抗體的靶蛋白之間 發(fā)生間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。反應(yīng)終止后，通過用蒸餾水將載片前后面洗滌三次并將載片在含有蒸 餾水的燒杯中浸泡1分鐘來除去未反應(yīng)的抗體和抗原。
[0135] 實(shí)施例8 :熒光圖像分析
[0136] 將按照實(shí)施例7進(jìn)行了間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的載片放在培養(yǎng)箱中干燥。利用熒光顯微鏡 對(duì)干燥好的載片進(jìn)行熒光圖像分析，并測(cè)量熒光強(qiáng)度和熒光顆粒的數(shù)量。圖6展示了熒光 分析使用的儀器，獲取的熒光圖像顯示出結(jié)合在載片表面的經(jīng)過間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的FSNP標(biāo) 記抗體的熒光點(diǎn)（參見圖5F)。圖7顯示了利用FSNP標(biāo)記抗體，通過測(cè)量由C反應(yīng)蛋白的濃 度依賴性熒光圖像獲得的相對(duì)熒光水平而得出的校準(zhǔn)曲線圖。當(dāng)樣本中CRP濃度提高時(shí)， 更多CRP與標(biāo)記抗體反應(yīng)，因此固定在載片上的抗原和標(biāo)記抗體之間的結(jié)合下降。此外，圖 形在非常低的C反應(yīng)蛋白濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性。這表明，利用這種免疫熒光載片測(cè)量CRP 時(shí)的檢測(cè)極限非常高，是〇. 1-1. 〇ng/ml。
[0137] 實(shí)施例9 :免疫熒光載片的制各
[0138] 根據(jù)實(shí)施例1-8,通過對(duì)30X70mm大小的顯微鏡用透明載片用3-氨丙基三甲氧基 硅烷或3-巰基丙基三甲氧基硅烷-N-γ馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行表面修 飾、并在上面固定1-100μI0.01-0. 5mg/mlC反應(yīng)蛋白，來制備一次性免疫熒光載片。
【權(quán)利要求】
1. 制備固定有抗原的免疫熒光載片的方法，所述方法包括：將C反應(yīng)蛋白固定在載片 上制備蛋白芯片；用熒光納米顆粒標(biāo)記能夠特異結(jié)合C反應(yīng)蛋白的抗體；將由標(biāo)本獲得的 靶蛋白與熒光標(biāo)記抗體混合，使混合液與載片上固定的抗原反應(yīng)，以及通過利用熒光顯微 鏡測(cè)量熒光強(qiáng)度或熒光顆粒的數(shù)量進(jìn)行分析， 其中用熒光納米顆粒對(duì)抗體進(jìn)行的標(biāo)記包括： 將鏈霉親和素修飾的熒光二氧化硅納米顆粒溶液超聲處理10-30分鐘； 取所得溶液200-600 ill加入l-3ml 0. 05-0. 25mg/ml生物素化抗體溶液中，室溫反應(yīng) 1-3小時(shí)，期間以30分鐘的間隔于30-200rpm的低速進(jìn)行攪拌，每次攪拌2-7分鐘； 反應(yīng)溶液在3-10°C的溫度下以7000-17000rpm的速率離心20-40分鐘，棄去上清液，收 集沉淀； 用30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH 6. 5-7.8)將沉淀物洗一到五次，每次洗滌后，在和以上 描述的相同的條件下離心，獲取沉淀物；和 將沉淀物重懸于〇. 4-1.2ml 30-70mM磷酸鹽緩沖液（pH 6. 5-7. 8)中。
2. 利用權(quán)利要求1所述方法制備的免疫熒光載片，其中所述免疫熒光載片是用3-氨丙 基三甲氧基硅烷或3-巰基丙基三甲氧基硅烷-N- Y馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰亞胺酯 進(jìn)行表面修飾過的，并且包含I-IOOu 1 〇. 01-0. 5mg/ml C反應(yīng)蛋白。
3. 利用權(quán)利要求2所述的免疫熒光載片測(cè)量標(biāo)本中C反應(yīng)蛋白的方法。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK104316698SQ201410498519
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2011年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2010年2月23日
【發(fā)明者】金南洙, 趙鏞珍, 金鐘泰 申請(qǐng)人:韓國(guó)食品研究院