一種利用囊胚培養(yǎng)液檢測胚胎染色體異常的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)和分子細胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用囊胚培養(yǎng)液對胚 胎染色體的狀態(tài)進行檢測和分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 試管嬰兒技術(shù)是一項對抗不孕不育的強大技術(shù)手段，其技術(shù)過程為，首先從母親 獲得多個卵子（通常8-15個），再W父親的精子對卵子進行體外受精，受精卵在體外培養(yǎng)液 中生長5天時，胚胎是由約80~100個細胞組成的囊狀結(jié)構(gòu)即囊胚，將2-3個囊胚放置入 母親子宮后，理想情況下，置入子宮的囊胚可有1個至3個按正常孕期成功發(fā)育，直至出生。 但由于各種原因，從囊胚置入子宮到胎兒出生的成功率不高，通常只有40%左右，除母親自 身的健康原因W外，受精卵質(zhì)量是導(dǎo)致囊胚發(fā)育失敗的重要原因之一。
[0003] 受精卵的染色體來自于母源的卵子和父源的精子，任何一方的染色體異常均導(dǎo)致 受精卵的染色體異常。正常人的受精卵、每個胚胎細胞及胎兒、嬰幼兒直至成人的每個細胞 內(nèi)均有44條即22對常染色體（稱為二倍體）和兩條性染色體（男性為XY，女性為XX)。在 異常情況下，任何染色體的全部或局部均可能出現(xiàn)多于或少于二倍體的情況，稱為非整倍 體異常，非整倍體異常是最常見的導(dǎo)致胚胎發(fā)育失敗的染色體異常形式。在常規(guī)試管嬰兒 技術(shù)中，僅依靠顯微鏡下的形態(tài)觀察，從多個（通常8-15個）胚胎中挑選2-3個相對"正 常"者置入母親子宮。而顯微鏡下的形態(tài)正常并無法反映染色體是否正常，錯誤地挑選形態(tài) 正常而染色體異常的胚胎置入母親子宮導(dǎo)致了很多試管嬰兒受孕失敗。 W04] 近年W來，人們已建立了一些技術(shù)，統(tǒng)稱為胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PreimplantationGeneticScreen,PG巧對體外培養(yǎng)胚胎的染色體狀態(tài)進行檢測，W篩選 染色體正常的胚胎置入母親子宮，從而提高受孕成功率。有研究表明，經(jīng)過PGS再置入子 宮的試管嬰兒操作可將成功率提高到60%W上，各種PGS方法包括免疫巧光檢測（FISH)， 忍片檢測，二代測序檢測等。上述各種檢測所需的生物樣本都是從體外培養(yǎng)胚胎中采集的 一個至數(shù)個細胞，通過對運少量細胞的檢測反映整個胚胎的染色體是否正常。
[0005] 具體而言，當(dāng)體外培養(yǎng)5天的受精卵發(fā)育至囊胚期時可提取胚胎滋養(yǎng)層細胞 (trophoblast)。一般操作為在顯微鏡下，用毛細玻璃管吸取一個至數(shù)個滋養(yǎng)層細胞將細胞 裂解，釋放其中的微量DNA，將微量DNA進行全基因組擴增后，可采用核酸忍片或二代測序 等方法檢測細胞的染色體狀態(tài)（參見發(fā)明專利申請CN104711362A，公開日為2015年6月 17日）。理論上講，吸取出來的幾個細胞中的染色體狀態(tài)與胚胎中其它細胞一致，檢測運幾 個細胞即可了解該胚胎的染色體狀態(tài)是否正常。一般認(rèn)為，此時吸取幾個滋養(yǎng)層細胞不會 對胚胎發(fā)育造成不良影響，從已出生嬰兒的健康狀況來看，運一操作也確實沒有健康影響。 但是，該技術(shù)出現(xiàn)的時間尚短（僅數(shù)年），其對人的終生健康是否存在遠期影響仍然有待觀 察。
[0006] 此外，人們也已研發(fā)出利用囊胚腔液進行胚胎質(zhì)量檢測的方法，首先在囊胚腔液 中獲取游離的DNA，即在顯微操作儀下使用微穿刺技術(shù)，利用無菌的針頭吸取得到囊胚腔 液游離DM(參見發(fā)明專利申請CN104450923A，公開日為2015年3月25日；W及期刊文 南犬Luca Gianaroli, Μ. Cristina Magli, Alessandra Pomante, et al. Blastocentesis:a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility, 2014, 102化）：1692-1698.)。然而，囊胚腔液是囊胚腔中的液 體，欲獲取囊胚腔液仍需要在囊胚上打桐或刺穿，其介入性仍會對胚胎造成不可避免的損 傷。
[0007] 綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)所存在的主要缺點為：
[0008] 1.細胞取樣時對胚胎操作技術(shù)要求較高，如果操作失誤、粗暴操作會導(dǎo)致胚胎嚴(yán) 重損傷，損傷過于嚴(yán)重可造成胚胎發(fā)育終止。
[0009] 2.即使良好操作，細胞取樣時不可避免地對胚胎造成細胞損失和輕微損傷。盡管 現(xiàn)在尚無證據(jù)表明細胞損失和輕微損傷會對胚胎發(fā)育和出生后健康發(fā)生不良影響，但該技 術(shù)出現(xiàn)的時間尚短（僅數(shù)年），其對人的終生健康是否存在遠期影響仍然有待觀察。
[0010] 3.在少數(shù)情況下，存在取樣獲得的幾個細胞的染色體狀態(tài)與胚胎中其它細胞的染 色體狀態(tài)不同的情況，導(dǎo)致檢測結(jié)果失誤。
[0011] 因此，一種不損傷胚胎本身，而又可W對胚胎染色體狀況進行檢查的非侵入性的 技術(shù)手段，是消除健康影響隱患、確保胚胎檢測安全性的現(xiàn)實需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用囊胚培養(yǎng)液檢測胚 胎染色體異常的方法，其不會對胚胎帶來任何損傷，操作簡單，安全性和可靠性更高。
[0013] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種利用囊胚培養(yǎng)液檢測胚胎染色體異常的方 法，其包括如下步驟：
[0014] (1)囊胚培養(yǎng)液的獲得：通過單精子注射方法獲得受精卵，將其培養(yǎng)至第3天卵 裂球期之后轉(zhuǎn)移至新制備的囊胚培養(yǎng)微滴中進行囊胚培養(yǎng)，此時在第3天進行換液是必須 的，目的是去除脫落的顆粒細胞及未受精精子的污染；
[0015] 將形成囊胚的胚胎吸出，轉(zhuǎn)移至新的囊胚培養(yǎng)液中或者進入玻璃化凍存流程，剩 余的原囊胚培養(yǎng)液約1微升至500微升，優(yōu)選10微升至200微升，即為進行胚胎植入前遺 傳學(xué)篩查（PGS)需要收集的樣本；
[0016] (2)囊胚培養(yǎng)液的采集：將步驟（1)中獲取的原囊胚培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至裂解液中，離屯、 后，樣本進入下一步的全基因組擴增步驟；
[0017] 做囊胚培養(yǎng)液中微量DNA的全基因組擴增：向步驟似中獲得的囊胚培養(yǎng)液與 裂解液的混合物中加入裂解酶，混勻后解育，而后使裂解酶失活，取出裂解產(chǎn)物加入PCR反 應(yīng)管中進行PCR反應(yīng)；
[0018] (4)將全基因組擴增后的DNA產(chǎn)物進行分析，W鑒定胚胎的染色體狀態(tài)是否正常： 分析時采用二代測序、核酸忍片或者免疫巧光檢測。
[0019] 其中，步驟似中裂解液的成分是PH為7. 0~8. 0的Tris-Cl25-45mM， 邸TAO. 5-3mM，KCl10-25mMW及濃度為0. 05 % -5 %的去污劑，所述去污劑為Triton X-100、TritonX-114、吐溫20、NP40和SDS中的一種或多種。優(yōu)選地，裂解液的成分為PH 為 7. 2 的Tris-Cl40mM，EDTAlmM，KCl15mMW及 3%的TritonX-100。
[0020] 步驟（3)中的裂解酶選自蛋白酶Κ、QiagenProtease、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、膜 蛋白酶和溶菌酶中的一種或多種，所述裂解酶的濃度為l-25yg/ml，優(yōu)選為20μg/ml;步 驟（3)中解育溫度為30-60°C，解育時間為Imin至12h，失活溫度為75-95°C，失活時間為 l-15min;優(yōu)選地，解育溫度為40°C，解育時間為化，失活溫度為90°C，失活時間為5min。
[0021] 步驟（3)中進行PCR反應(yīng)時的PCR反應(yīng)管中含有擴增混合液、0.5% -20%的PCR抑 制物對抗劑、5-20mM dNTP、5-100μΜNG和NT引物、50-200μΜ擴增引物、0.5-10單位核酸 聚合酶，所述PCR抑制物對抗劑選自DMS0、甜菜堿、甲酯胺、甘油和白蛋白中的一種或多種， 所述核酸聚合酶選自化i29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent聚合酶、Deep Vent聚合酶、 Klenow Rragment DNA聚合酶I、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、HIV反轉(zhuǎn)錄酶、Phusion取.超 保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、E. coli DNA聚合酶、LongAmp Taq DNA聚合酶和OneTaq DNA 聚合酶中的一種或多種。
[0022] 所述擴增混合液的成分為 10-25mMTris-肥 1，5-25mM(畑4)2SO4, 5-30mMKC1， 0. 5-5mMΜ