俄羅斯野山參的多重pcr鑒定方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本1發(fā)明屬于野山參及其制品的分子生物學(xué)鑒定方法，特別是設(shè)及一種利用DNA 分子標(biāo)記對俄羅斯野山參和國內(nèi)人參進行區(qū)分和鑒定的方法及其專用引物與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參是五加科植物人參（PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥根及根莖。根據(jù)人參 的生長方式不同可W分為野山參、林下參、園參等。由于市場的廣泛需求及野山參的溯臨滅 絕，目前林下參和園參是市場上人參藥材的主要來源。傳統(tǒng)野生人參有兩大主產(chǎn)區(qū)，一個是 現(xiàn)在的吉林通化縣為中屯、地域的長白山區(qū)，另一個是烏蘇里江W東的錫赫特山區(qū)。但是，道 光二十年（1840)鴉片戰(zhàn)爭W后，通過《中俄環(huán)渾條約》與《中俄北京條約》將烏蘇里江W東 約四十萬平方公里的中國領(lǐng)上強行劃歸俄國。從此，使中國的人參主產(chǎn)區(qū)之一烏蘇里江W 東的錫赫特山區(qū)喪失殆盡。
[000引 目前，我國長白山區(qū)的野生人參已溯臨滅絕，非常稀少，民間貿(mào)易也非常稀少。而 產(chǎn)于俄羅斯錫赫特山區(qū)的野生人參由于受到較好的保護，產(chǎn)量比較客觀，在民間形成較大 的貿(mào)易量。但是，由于俄羅斯野山參價格昂貴，導(dǎo)致市場上出現(xiàn)用其它人參冒充俄羅斯野山 參的情況，因此，市場上需要對是否為俄羅斯野山參進行鑒別。傳統(tǒng)的野山參與林下參或園 參的鑒別主要采用表型性狀法，但運種方法會受到環(huán)境、人參生長發(fā)育階段、人為主觀因素 等影響，尤其是多數(shù)人參制品為初加工或深加工后產(chǎn)品，失去了原來的性狀，因此表型性狀 法有很大的局限性。俄羅斯野山參的化學(xué)鑒定法主要W皂巧分析為主，但化學(xué)法需要的前 處理過程復(fù)雜，而且部分野山參制品受到人參加工過程的影響，皂巧的含量非常低，會妨礙 俄羅斯野山參的鑒定。因此，需要一種更為有效和準(zhǔn)確鑒定俄羅斯野山參及其制品的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明利用發(fā)現(xiàn)的俄羅斯野山參的單核巧酸多態(tài)性位點（SN巧設(shè)計了俄羅斯野 山參的特異性引物，并利用多重PCR建立了俄羅斯野山參（Russianwildginseng)區(qū)別于 其他人參（如中國人參化ineseginseng)的鑒定方法。
[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專用引物。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專用引物，包括俄羅斯野山參 的特異性引物nad7wR(序列表中SEQIDNo:3)。也可W包括人參線粒體氧化還原脫氨酶 nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子（intron3)的通用側(cè)翼引物nad73F(序列表中SEQIDNo:1)和 nad73R(序列表中沈QIDNo:2)。
[0007] 俄羅斯野山參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子序列如序列表中 SEQIDNo:4所示（中國人參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子序列如序 列表中SEQIDNo:5所示）。
[0008] 俄羅斯野山參的特異性引物nad7wR(序列表中SEQIDNo:3)是根據(jù)俄羅斯野山 參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子中的單核巧酸多態(tài)性（SN巧位點（序 列表中SEQIDNo:4)設(shè)計的，自5'端第700位堿基俄羅斯野山參為G(中國人參為Τ)。
[0009] 上述俄羅斯野山參特異性引物nad7wR引物序列的衍生序列也屬于本發(fā)明。所述 衍生序列是指在本發(fā)明引物的基礎(chǔ)上，在序列的5'端和/或3'端再添加、減少一個或多個 堿基得到的序列。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法。
[0011] 本發(fā)明所提供的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，是用上述引物對待測人參的 基因組DNA進行多重PCR擴增，然后對多重PCR擴增產(chǎn)物進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測， 俄羅斯野山參可W出現(xiàn)由通用引物nad73F和nad73R擴增出的99化P的DNA條帶W及由特 異性引物nad7wR擴增出的72化P的特異性條帶（中國人參僅出現(xiàn)由通用引物nad73F和 nad73R擴增出的992bp的DNA條帶）。
[001引所述20μΙ多重PCR反應(yīng)體系為：lyL(lOng)人參基因組DNA，0. 1化(0. 05μΜ) 引物nad7wR，2μL(1μΜ)引物nad73F，2μL(1μΜ)引物nad73R，4. 9μL滅菌超純水，10μL 2XPremixDNApolymerase(配方：2μΙlOXEasyTaqbuffer'I.GOyL2.5mMdNTPs， 0. 4μLEas}fTaqDNApolymerase, 6μL&0)。
[0013] 多重PCR反應(yīng)條件為：先 94°C預(yù)變性 4min;然后 94°C30s，54°C30s，72°C30s，共 33個循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫。
[0014] 本發(fā)明的第Ξ個目的是提供一種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定試劑盒。
[0015] 本發(fā)明所提供的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定試劑盒，包括上述人參線粒體氧化 還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子的通用側(cè)翼引物nad73F和nad73R及俄羅斯野山參 的特異性引物nad7wR。
[0016] 本發(fā)明提供了俄羅斯野山參的多重PCR鑒定技術(shù)，從而可達到準(zhǔn)確鑒定俄羅斯野 山參的目的。本發(fā)明可W解決人參市場上俄羅斯野山參商品的鑒別和商品價值的評價問 題，為俄羅斯野山參的鑒別提供了客觀標(biāo)準(zhǔn)，將對規(guī)范人參市場和保證人參產(chǎn)業(yè)的良性發(fā) 展發(fā)揮重要作用。
[0017] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
【附圖說明】
[001引圖1為俄羅斯野山參與普通人參的nad7基因中第Ξ個內(nèi)含子的核巧酸序列比對 結(jié)果；
[0019] 圖2為俄羅斯野山參與普通人參的多重PCR鑒定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明是基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了俄羅斯野山參的單核巧酸多態(tài)性位點（SN巧而做出。
[0021]單核巧酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymo;rphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只設(shè)及到單個堿 基的變異，運種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換（transition)或顛換（transversion)所引起，也 可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。運種變異可能是轉(zhuǎn) 換（C一T，在其互補鏈上則為G-A)，也可能是顛換（C一A，G-T，C一G，A-T)。轉(zhuǎn)換 的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3,其它幾種變異的發(fā) 生幾率相似。
[0022]SNP檢測方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DM測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)、 限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP)、等位基因特異的寡聚核巧酸雜交（AS0)等，也采用根 據(jù)DNA列陣的微測序法、動態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核巧酸特異的連接、DNA忍片W及 化qMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進行祀序列的擴增，然后才能進行其它檢測。
[0023] 本發(fā)明W下述實施例詳細介紹利用俄羅斯野山參的單核巧酸多態(tài)性位點實施SNP 檢測技術(shù)對俄羅斯野山參的鑒別。
[0024] 實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《Molecular Cloning:ALaboratoryManual》 （Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:A LaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。
[00巧]實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑W達 到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的 來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可W按照實施例中的提 示替換使用。
[0026] 所有引物合成及序列測定工作均由北京全式金生物技術(shù)有限公司完成。
[0027] 實施例在W本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的 操作過程，實施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0028] 實施例1、俄羅斯野山參多重PCR鑒定
[0029] 一、設(shè)計用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專用引物
[0030] 根據(jù)Genbank中的俄羅斯野山參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含 子（intron3)序列（冊241271)及其突變位點設(shè)計用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專用 引物。
[0031] 1、設(shè)計人參通用的內(nèi)含子側(cè)翼引物
[0032] 利用引物設(shè)計軟件PrimerPremie巧設(shè)計俄羅斯野山參和對照人參（中國人參） 線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子側(cè)翼引物，分別為
[0033] nad73F:巧，-CAACAACGGTTCTGCCTGAC-3，，序列表中沈QIDNo:1)和
[0034] nad73R:(5, -GCCCACCACTTAACTTTCAC-3,，序列表中沈QIDNo:2)。
[0035] 2、俄羅斯野山參和對照人參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個內(nèi)含子 (intro