（1.OmL)，升至室溫震搖反應(yīng)4h，將樹(shù)脂濾除，得粗產(chǎn)物；向粗產(chǎn)物中加入8倍體積 的冷乙醚（〇°C)，離心收集白色固體，減壓干燥，得到直鏈八肽。
[0140] 2)采用縮合試劑將所得直鏈八肽進(jìn)行環(huán)化后得到所述短瓣花環(huán)肽A:
[0141] 將步驟（1)制備的直鏈八肽溶于DMF(lOml)中，加入DIEA(19yL，0.llmmol)及縮 合試劑（0.lmmol)，得到的反應(yīng)混合液在室溫下攪拌反應(yīng)72h，減壓蒸除溶劑，向得到的白 色固體中加入水，攪拌30min，離心收集白色固體，加入少量DMS0/H20溶解固體產(chǎn)物，用制備 型HPLC純化，收集產(chǎn)物，冷凍干燥，得到產(chǎn)物BrachysteminA(產(chǎn)率為53% )，其中，縮合試 劑為HBTU。
[0142] 實(shí)施例4
[0143] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，所述短瓣花環(huán)肽A的結(jié) 構(gòu)為環(huán) _(Pro1-Pro2-Ala3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，包括如下步驟：
[0144] 1)合成直鏈八肽，所述直鏈八肽從C端到N端的序列為：
[0145]Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8〇
[0146] (1-1)溶脹：在一個(gè) 10mL的固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Gly-Wang(0. 5mmol/g， 150mg，0· 054mmol)樹(shù)脂以及CH2C12 (3ml)，溶脹樹(shù)脂30min，其中，F(xiàn)moc為芴基甲氧羰基，Gly 為直鏈八肽C端的第一個(gè)氨基酸；
[0147] 脫保護(hù)：抽除CH2C12，用20%哌啶/DMF溶液（3ml)脫除Fmoc保護(hù)基，10min后，用 DMF(3mL)洗滌樹(shù)脂，重復(fù)洗滌4次，再用無(wú)水DMF(3mL)洗滌樹(shù)脂，得到脫除Fmoc的氨基酸 樹(shù)脂。
[0148] (1-2)在活化劑的存在下，將Fmoc-AA2-0H單體氨基酸分別進(jìn)行酰氯化處理，得到 Fmoc-AA2-Cl單體氨基酸酰氯：
[0149] 同時(shí)將三光氣（BTC)和Fmoc保護(hù)的單體氨基酸（Fmoc-AA2-0H)按0. 67:1的摩爾 比溶于無(wú)水THF(1ml)，在30°C下，向該溶液中緩慢滴加二甲基吡啶（反應(yīng)立即產(chǎn)生大量沉 淀），反應(yīng)3min后，再加入DIEA/DMF溶液（10%，v/v，2ml)，沉淀消失，得到含有單體氨基酸 酰氯（Fmoc-AA2-Cl)的反應(yīng)溶液；
[0150] 其中，三甲基吡啶的加入量為Fmoc-AA2-0H摩爾量的6倍；DIEA的加入量為 Fmoc-AA2-0H摩爾量的8倍；
[0151] (1-3)第一次縮合反應(yīng)：將步驟（1-2)所得的含有單體氨基酸酰氯（Fmoc-Ala-Cl) 的反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移到步驟（1-1)所得的脫除Fmoc的氨基酸樹(shù)脂中，隊(duì)鼓泡混勻，室溫下，縮合 反應(yīng)0. 5h，（用茚三酮試劑或四氯苯醌試劑檢測(cè)至反應(yīng)完全），得到反應(yīng)產(chǎn)物，所述反應(yīng)產(chǎn) 物中含有氨基酸樹(shù)脂（具有二肽），用DMF(3mL)洗滌樹(shù)脂，重復(fù)洗滌4次后，采用步驟（1-1) 中所述的脫保護(hù)的方法處理氨基酸樹(shù)脂，然后進(jìn)入下一個(gè)縮合反應(yīng)；
[0152] 后續(xù)的縮合反應(yīng)按照直鏈八肽從C端到N端的序列依次添加相應(yīng)的氨基酸單體， 步驟參照第一次縮合反應(yīng)，7次縮合反應(yīng)后制得含有直鏈八肽樹(shù)脂的反應(yīng)產(chǎn)物，其中，每次 縮合反應(yīng)中，單體氨基酸酰氯的摩爾數(shù)和氨基酸樹(shù)脂的總?cè)〈抵葹?:1 ;所述直鏈八 肽從C端到N端的序列為：
[0153]Gly1-Ala2-Pro3-Pro4-Phe5-Thr6-Ala7-Leu8〇
[0154] (1-4)分另ij種用DMF(3mL)和Me0H(2mL)洗滌步驟（1-3)制備的直鏈八肽樹(shù)脂，分 別洗滌2次和4次，然后用N2吹干樹(shù)脂。在0°C下加入TFA/TES/H20 (體積分?jǐn)?shù)：95:2. 5:2. 5) 混合溶液（1.OmL)，升至室溫震搖反應(yīng)4h，將樹(shù)脂濾除，得粗產(chǎn)物；向粗產(chǎn)物中加入8倍體積 的冷乙醚（〇°C)，離心收集白色固體，減壓干燥，得到直鏈八肽。
[0155] 2)采用縮合試劑將所得直鏈八肽進(jìn)行環(huán)化后得到所述短瓣花環(huán)肽A:
[0156] 采用實(shí)施例1的環(huán)化方法，不同的是縮合劑分別采用HATU和DMTMM+C1，所得短瓣 花環(huán)肽A產(chǎn)率分別為68 %和59%。
[0157] 此外，本發(fā)明還對(duì)實(shí)施例1的步驟（2)采用了不同摩爾比的DMTMM+BF4_和0此八進(jìn) 行環(huán)化，各實(shí)施例步驟（2)的具體設(shè)置對(duì)比如下表：
[0158]
[0159] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，所述短瓣花環(huán)肽A的結(jié)構(gòu)為環(huán)-(Pri-Prc^-Ala 3-Gly4-Leu5-Ala6_Thr7-Phes)，其特征在于，包括如下步驟： 1) 合成直鏈八肽： (1-1)提供Fmoc-AAi-樹(shù)脂，采用去保護(hù)劑脫除Fmoc保護(hù)基，得到氨基酸樹(shù)脂，其中，F(xiàn)moc為荷基甲氧羰基，AAi為直鏈八肽C端的第一個(gè)氨基酸； (1-2)在活化劑的存在下，將Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸分別進(jìn)行酰氯化處理，得到Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯，其中，AAn為直鏈八肽C端的第η個(gè)氨基酸，η為2~8的自 然數(shù)，所述活化試劑為光氣、雙光氣和三光氣中的至少一種； (1-3)堿性條件下，按照η取值分別為2到8的順序，分別將各Fmoc-AAn-Cl單體氨基 酸酰氯和樹(shù)脂上的氨基酸依次進(jìn)行縮合，每縮合一次后，先采用去保護(hù)劑處理縮合所得氨 基酸樹(shù)脂，脫除Fmoc保護(hù)基后再進(jìn)入下一次縮合反應(yīng)，待全部縮合完成后，得到直鏈八肽 樹(shù)脂，其中，第一次縮合采用步驟（1-1)的氨基酸樹(shù)脂； (1-4)在切割劑的存在下，使直鏈八肽樹(shù)脂上的多肽和樹(shù)脂分離，得到所述直鏈八肽； 2) 采用縮合試劑將所得直鏈八肽進(jìn)行環(huán)化后得到所述短瓣花環(huán)肽A。2. 如權(quán)利要求1所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述直鏈八肽C端 的第一個(gè)氨基酸為丙氨酸、甘氨酸或亮氨酸。3. 如權(quán)利要求1所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步驟（1-1) 中，所述Fmoc-AAi-樹(shù)脂取代值為0. 1~1.Ommol/g。4. 如權(quán)利要求1所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述采用活化劑制 備各種Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯的步驟包括： 將Fm〇c-AAn-0H單體氨基酸和活化劑溶于惰性溶劑中，0~30°C下加入第一有機(jī)堿反 應(yīng)1~30分鐘，得到Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯； 其中，以雙光氣、三光氣換算成光氣后的摩爾數(shù)計(jì)算，所述活化劑中總光氣的摩爾數(shù)為 所述Fmoc-AAn-OH單體氨基酸的摩爾數(shù)的0. 99~2. 01倍。5. 如權(quán)利要求4所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述惰性溶劑為四 氫呋喃（THF)、二噁烷、二甘醇二甲醚和1，3_二氯丙烷中的至少一種。6. 如權(quán)利要求4所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述第一有機(jī)堿為 三甲基吡啶、二異丙基乙胺、吡啶、二甲基吡啶或2-甲基喹啉。7. 如權(quán)利要求1所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步驟（1-3) 中，每次縮合反應(yīng)中，各Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸酰氯和樹(shù)脂上的氨基酸進(jìn)行縮合的步驟包 括： 將待縮合的Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸酰氯、第二有機(jī)堿和氨基酸樹(shù)脂溶于第二有機(jī)溶 劑中，惰性氣體鼓泡條件下反應(yīng)〇. 5~2小時(shí)，完成一次縮合反應(yīng)； 其中，所述Fmoc-AAn-〇H單體氨基酸酰氯的摩爾數(shù)為氨基酸樹(shù)脂取代值總摩爾數(shù)的 2~8倍；所述第二有機(jī)堿為N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉和三乙胺中的至少一種。8. 如權(quán)利要求7所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述第二有機(jī)溶劑 為DMF和NMP中的至少一種。9. 如權(quán)利要求1所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步驟（4)中， 所述縮合試劑為DMTMM+BF4、DMTMM+C1，DCC、DIC、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、PyBOP、 PyAOP、FDP和FDPP中的任意一種或兩種。10. -種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，所述短瓣花環(huán)肽A的結(jié)構(gòu)為環(huán)-(Pri-Prc^-Al a3-Gly4-Leu5-Ala6-Thr7-Phe8)，其特征在于，包括如下步驟：SOI)合成直鏈八肽；S02)將所 述直鏈八肽進(jìn)行環(huán)化后得到所述短瓣花環(huán)肽A;其中，所述直鏈八肽C端的第一個(gè)氨基酸為 Pro、Ala、Gly、Leu、Thr或Phe〇11. 如權(quán)利要求10所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步驟（SOI) 中，縮合反應(yīng)為活潑酯法，采用的酰胺鍵縮合試劑為DMTMM+BF4、DMTMM+C1，DCC、Die、HATU、 HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、PyBOP、PyAOP、FDP和FDPP中的任意一種或兩種。12. 如權(quán)利要求10所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，其特征在于，所述步驟（SOI) 中，縮合反應(yīng)中采用活化劑將單體氨基酸中的羧基原位轉(zhuǎn)化成單體氨基酸酰氯，然后在堿 性條件下，所述單體氨基酸酰氯與樹(shù)脂上的氨基酸縮合；其中，所述活化劑為光氣、雙光氣 和三光氣中的至少一種。13. -種如權(quán)利要求1或權(quán)利要求10所述的短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法在制備短瓣 花環(huán)肽A藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法，包括如下步驟：1)合成直鏈八肽：(1-1)提供Fmoc-AA1-樹(shù)脂，采用去保護(hù)劑脫除Fmoc保護(hù)基；(1-2)在活化劑的存在下，將Fmoc-AAn-OH單體氨基酸分別進(jìn)行酰氯化處理，得到Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯；(1-3)堿性條件下，分別將各Fmoc-AAn-Cl單體氨基酸酰氯和樹(shù)脂上的氨基酸依次進(jìn)行縮合，得到直鏈八肽樹(shù)脂；(1-4)在切割劑的存在下，使直鏈八肽樹(shù)脂上的多肽和樹(shù)脂分離，得到所述直鏈八肽；2)采用縮合試劑將所得直鏈八肽進(jìn)行環(huán)化后得到所述短瓣花環(huán)肽A。本發(fā)明提供了一種短瓣花環(huán)肽A的固相合成方法的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】C07K1/04, C07K1/06, C07K1/08, C07K7/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105418737
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410466138
【發(fā)明人】粟武, 房麗晶, 武春雷, 余再丹, 鵬越峰
【申請(qǐng)人】深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2014年9月12日