豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒多重rt-pcr檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病毒的檢測(cè)方法，具體涉及一種豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹 瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬德?tīng)査跔畈《荆≒oreineDe1tacoronavirus，PDCoV)屬于尼多病毒目 (Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)的Delta冠狀病 毒，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。早在2012年，Woo等發(fā)表的文章中就有H)CoV的報(bào)道:他們 對(duì)廣東和香港等地采集的哺乳動(dòng)物和禽類病料進(jìn)行Delta冠狀病毒檢測(cè)，其中在豬糞便樣 品（169份）中檢測(cè)到近10%的PDCoVdOH年初，美國(guó)俄亥俄州首次檢測(cè)報(bào)道一種新的豬腸 道冠狀病毒H)C〇V，截止2014年底，美國(guó)發(fā)現(xiàn)roc〇v感染病例達(dá)17個(gè)州。隨后在加拿和韓國(guó)也 報(bào)道檢測(cè)到了PDCoV，其陽(yáng)性檢出率高達(dá)25 %。豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemic diarrheavirus，PEDV)與FOCoV屬于同一個(gè)科，但是屬于Alpha冠狀病毒。首次報(bào)道于英國(guó)， 此后在世界多國(guó)均見(jiàn)有PEDV感染的報(bào)道，我國(guó)于1976年有PEDV感染的報(bào)道。自20世紀(jì)80年 代后期PEDV在我國(guó)呈現(xiàn)大面積流行

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒多重RT-PCR檢 測(cè)引物及檢測(cè)方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)引 物：
[0005]豬德?tīng)査跔畈《镜囊镄蛄腥缦拢?br>[0006]上游引物PI :5'-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3'
[0007]下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 '
[0008]擴(kuò)增豬德?tīng)査跔畈《净虿糠制?83bp;
[0009]豬流行性腹瀉病毒的引物序列如下：
[0010]上游引物P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3 '
[0011]下游引物P4:5'-TGTAACGCTAACACTCCTT-3'
[0012] 擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒基因部分片段101bp。
[0013]利用所述引物檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒多重RT-PCR的方法，該 方法不用于疾病的診斷和治療，包括提取病毒的DNA后，按如下多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體 系和反應(yīng)條件對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)：
[0014]所述多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系，在25μ1體系中加入以下成份：
[0016]所述反應(yīng)條件為：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min〇
[0017] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明根據(jù)GenBank中登錄的豬Deltacoronavirus(PDCoV) 和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物分別用于擴(kuò)增roCoVN基因和PEDVΜ基因的目的片段。通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè)PDCoV和PEDV的多重RT-PCR診 斷方法。敏感性和特異性結(jié)果顯示，該多重RT-PCR對(duì)H)C〇V和PEDV的最低檢測(cè)量分別是4.05 X101拷貝和4.52X103拷貝/VL，而對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，博卡病毒(PBoV)，豬 繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬輪狀病毒(RV)的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。應(yīng)用該方法和單 重PCR對(duì)57份臨床樣品的多重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，同時(shí)感染這2種病毒的陽(yáng)性率為8.77%，感 染H)CoV陽(yáng)性率為19.30 %，感染PEDV陽(yáng)性率為26.32 %。結(jié)果表明，建立多重PCR方法能夠?qū)?PDCoV和PEDV單個(gè)或混合感染的臨床樣品進(jìn)行快速鑒別診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1多重RT-PCR電泳圖，M:DL2000DNA marks l:PDCoV and PEDV 2:PDCoV 3: PEDV4:陰性對(duì)照；
[0019]圖2多重RT-PCR特異性試驗(yàn)，M:DL2000DNA marks l:PDCoV、PEDV多重PCR產(chǎn)物；2~ 7分別是:PDCoV、PEDV、TGEV、PBoV、PRRSV、RV的PCR產(chǎn)物;8:陰性對(duì)照；
[0020]圖3PDCoV的RT-PCR敏感性試驗(yàn)，M:DL2000DNA marks 1~9:4·05Χ108拷貝/yL~ 4.05X10°拷貝ΛΛ10:陰性對(duì)照；
[0021] 圖4PEDV的RT-PCR敏感性試驗(yàn)，M:DL2000DNAmarksl~9:4·52X108拷貝/μL~ 4.52X10°拷貝ΛΛ10:陰性對(duì)照；
[0022]圖5多重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)，M:DL2000DNA marks 1~8:107~10Q拷貝/yL 9:陰 性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明根據(jù)GenBank登錄的PDCoV的HKU15-155株N基因序列，PEDV的JXNC1302株Μ 基因序列，通過(guò)序列分析獲得其高度保守的特異性序列，并根據(jù)該特異性保守序列設(shè)計(jì)了 兩對(duì)特異性引物。在此基礎(chǔ)上建立了roCoV和PEDV的多重RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)此方法進(jìn)行 了評(píng)價(jià)分析。對(duì)河南地區(qū)送檢的病料樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，進(jìn)一步在實(shí)踐中驗(yàn)證方法的可靠 性，從而為獸醫(yī)臨床的診斷和治療提供理論依據(jù)。
[0024]豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒多重RT-PCR檢測(cè)引物：
[0025]豬德?tīng)査跔畈《镜囊镄蛄腥缦拢?br>[0026]上游引物PI:5'-GCGTTTCCTGGGCTGATT-3,
[0027]下游引物P2:5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3'
[0028]擴(kuò)增豬德?tīng)査跔畈《净虿糠制?83bp;
[0029]豬流行性腹瀉病毒的引物序列如下：
[0030]上游引物P3:5' -TGGCGACTGTGACGAAAT-3 '
[0031]下游引物P4:5'-TGTAACGCTAACACTCCTT-3'
[0032]擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒基因部分片段lOlbp。
[0033]利用所述引物檢測(cè)豬德?tīng)査跔畈《竞拓i流行性腹瀉病毒多重RT-PCR的方法，該 方法不用于疾病的診斷和治療，包括提取病毒的DNA后，按如下多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體 系和反應(yīng)條件對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)：
[0034]所述多重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)體系，在25μ1體系中加入以下成份：
[0036]所述反應(yīng)條件為：95°C5min，94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min〇
[0037] 本發(fā)明具體操作為：
[0038] 1材料和方法
[0039] 1.1病毒和細(xì)胞
[0040]豬DeltaC〇r〇naViruS(PDC〇V)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)、豬博卡病毒(PBoV)、豬輪狀病毒(RV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、LLC-PK細(xì) 胞、Vero細(xì)胞均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。PDCoV接種ST細(xì) 胞、PEDV接種Vero細(xì)胞傳至8代后出現(xiàn)80%以上的細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收毒。同時(shí)設(shè)正常未接 毒的細(xì)胞為陰性對(duì)照。
[0041 ] 1 · 2主要試劑
[0042]pMD18-T載體、QIAampViralRNAMiniKit提取試劑盒和QIAGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu) 自QIAGEN公司、2XTaqPCRMix酶、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司； TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。
[0043] 1.3引物的設(shè)計(jì)及合成
[0044]應(yīng)用PrimerPremier5 · 0基因分析軟件，參照Genbank中登錄的]^CoVN基因、 PEDVΜ基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1)，擴(kuò)增PDCoVN基因部分片段383bp，TODVΜ基因部分片段 l〇lbp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用雙蒸水稀釋為25ymol/L，-20°C 保存。
[0045] 表1多重RT-PCR引物信息
[0046]
[0047] 1.4病毒核酸的提取
[0048]接毒細(xì)胞懸液和臨床樣品于_80°C反復(fù)凍融3次后用于病毒核酸的提取。參照 QIAampViralRNAMiniKit提取試劑盒提取病毒總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備反轉(zhuǎn)錄 為cDNA，-80°C保存。
[0049] 1.5PCR產(chǎn)物的鑒定
[0050] 單一病毒的RT-PCR反應(yīng)在25yL體系中進(jìn)行，包括2XTaqDNAMasterMix15yL，上 下游引物各ΙμLΧ25μL?〇1/υ，cDNA模板4yL，ddH2〇補(bǔ)足25μΙ^ΡΟ?反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)為：95°C5min， 94°Clmin，58°C30s，72°C30s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOminJCR產(chǎn)物經(jīng)2.0 %瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，將回收的目的片段與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。
[0051 ] 1 · 6單一RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化
[0052]在25yL體系中進(jìn)行