檢測乙型肝炎病毒核酸的引物組、探針、試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒（HBV)核酸的檢測。更具體地，本發(fā)明涉及針對HBV多 個保守基因序列的特異性引物、引物組和/或探針，包含HBV特異性引物組和/或探針的用 于特異性檢測HBV核酸的組合物，包含所述組合物的HBV高靈敏性檢測試劑盒，以及用于高 靈敏特異性檢測HBV核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，我國屬于乙型肝炎感染地 方性流行區(qū)。HBV感染是多種肝臟疾病的主要原因，長期HBV感染易引起慢性肝炎、肝硬化、 肝衰竭和原發(fā)性肝癌等疾病。因此，對慢性乙型肝炎進行積極的治療或干預具有重要的意 義。乙肝病毒復制是慢性乙型肝炎活動的根本原因。因此，需要定期對乙肝患者體內(nèi)的HBV 病毒水平進行準確地定量檢測，以確定慢性乙型肝炎的治療時機和治療方案。
[0003]HBV病毒水平的定量檢測除用于慢性乙肝的監(jiān)測外，感染者外周血中HBV的病毒 載量也是決定是否需要抗病毒治療的重要指標，用藥后病毒載量的變化也是判斷抗病毒治 療效果的重要依據(jù)，對判斷療效、預后和耐藥發(fā)生至關(guān)重要，是對治療方案進行優(yōu)化和調(diào)整 的重要依據(jù)。因此，高敏感高特異的HBV核酸定量檢測方法對乙肝的治療具有重要的臨床 指導意義。
[0004] 目前國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)普遍采用國產(chǎn)的熒光定量PCR試劑來監(jiān)測患者外周血 中的HBV病毒載量。此類國產(chǎn)試劑相比進口試劑往往價格較便宜，但普遍存在靈敏度不高， 重復性較差，對于較低水平的病毒載量（低于30IU/ml)往往不能準確地檢出等問題。目前 在國內(nèi)應用較多的進口試劑主要有羅氏的COBASamplicor及COBASTaqman，其中C0BAS TaqmanHBVDNA檢測是美國批準的唯一一種采用Taqman技術(shù)的自動控制技術(shù)，是慢性乙型 肝炎臨床實踐指南中推薦的HBVDNA檢測方法。該方法具有靈敏度高、線性范圍寬、重復性 好等優(yōu)點，檢測范圍可達20IU/ml~1.7X10sIU/ml，但其設備昂貴，檢測費用高，目前還難 以在臨床上廣泛應用，特別是經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)。另外，其檢測下限為20IU/ml，治療后病人 體內(nèi)的HBVDNA水平可能低于其檢測下限而被漏檢。因此，目前亟需一種更加高靈敏、高特 異、重復性好的HBV核酸的檢測方法，以指導慢性乙型肝炎的臨床治療。
[0005] 此外，目前市場上的HBVDNA檢測試劑一般針對HBV基因中遺傳變異較小的基因 區(qū)進行檢測，如S區(qū)，C區(qū)，X區(qū)等。雖然這些區(qū)域較為保守，但也具有低概率的變異，如突 變，且不同亞型之間的序列也存在多態(tài)性。如果在引物探針結(jié)合的堿基序列中發(fā)生變異或 存在多態(tài)性，就有可能導致PCR擴增失敗而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，影響對HBV感染的診斷及慢性 乙型肝炎的治療。如果同時針對HBV的兩個或多個保守基因進行檢測，則可以避免上述假 陰性結(jié)果的出現(xiàn)，從而大大提高檢測試劑盒的靈敏度和準確性。目前已有針對HBV兩個基 因區(qū)同時進行檢測的報道，如凱杰生物工程（深圳）有限公司在專利"用于檢測人乙型肝炎 病毒的引物組和探針"中的關(guān)于同時檢測HBVS區(qū)及前核心區(qū)的報道。雖然相比于單基因 檢測，雙基因檢測能大大降低漏檢的風險，但當兩個基因同時存在突變時，也可能會導致擴 增失敗而漏檢。另外，目前的方法仍存在檢測靈敏度低（檢測限僅為20IU/ml)、定量限低 (僅為40IU/ml)等問題。因此，仍然需要一種靈敏度更高、特異性更好、突變包容性更好的 HBV核酸定量檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目標在于提供能滿足上述要求的用于高靈敏檢測 HBV核酸的引物組、探針以及包含所述引物組和探針的試劑盒。本發(fā)明的引物組和探針可以 同時檢測HBV基因的三個保守基因區(qū)域，因此可解決因HBV其中一個或兩個基因序列突變 而產(chǎn)生漏檢的問題。此外，為了解決由于不同基因型之間擴增效率差異而敏感度不同的問 題，本發(fā)明在引物和探針的變異位置引入了核苷類似物I堿基，提高了引物和探針對不同 基因序列的包容性，以保證不同基因型都具有較高的敏感性。
[0007] 本發(fā)明為了解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測乙型肝炎病毒核酸的引物組，所述引物組 包括至少一種選自以下的引物組：
[0009] (1)引物組1，其包含具有SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0010] ⑵引物組2,其包含具有SEQIDN0. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 4 所示的核苷酸序列的引物；和
[0011] ⑶引物組3,其包含具有SEQIDN0. 5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 6 所示的核苷酸序列的引物。
[0012] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測乙型肝炎病毒核酸的探針，所述探針包 括至少一種選自以下的探針，或者包括至少一種以下序列的反向互補序列：
[0013] (1)探針1，其具有如SEQIDN0. 7所示的核苷酸序列；和
[0014] (2)探針2,其具有如SEQIDN0. 8所示的核苷酸序列；和
[0015] (3)探針3,其具有如SEQIDN0.9所示的核苷酸序列；
[0016] 以上用于檢測HBV核酸的探針的一個末端標記熒光基團，且用于檢測HBV核酸的 探針的另一個末端標記淬滅基團。其中用于檢測HBV核酸的探針的一個末端所標記的熒光 基團為FAM、R0X、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一種，但 并不限于上述幾種；用于檢測HBV核酸的探針另一個末端所標記的淬滅基團為BHQ、TAMRA、 MGB和DABCYL中的任一種，但并不限于上述幾種。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測乙型肝炎病毒核酸的組合物。在一個實 施方式中，所述組合物包含具有堿基序列SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引物對和具有堿 基序列SEQIDN0. 7的探針；在另一個實施方式中，所述組合物包含具有堿基序列SEQID NO. 3和SEQIDNO. 4的引物對和具有堿基序列SEQIDNO. 8的探針；在再一個實施方式中， 所述組合物包含具有堿基序列SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6的引物對和具有堿基序列SEQ IDN0. 9的探針；在又一個實施方式中，所述組合物包含具有堿基序列SEQIDNO. 1和SEQ IDNO. 2的引物對、具有堿基序列SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引物對和具有堿基序列 SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 8的探針；在又一個實施方式中，所述組合物包含具有堿基序列 SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2的引物對、具有堿基序列SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6的引物 對和具有堿基序列SEQIDNO. 7和SEQIDNO. 9的探針；在又一個實施方式中，所述組合物 包含具有堿基序列SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引物對、具有堿基序列SEQIDNO. 5和 SEQIDNO. 6的引物對和具有堿基序列SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9的探針；在又一個實 施方式中，所述組合物包含具有堿基序列SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2的引物對、具有堿基 序列SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4的引物對、具有堿基序列SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6 的引物對和具有堿基序列SEQIDNO. 7、SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9的探針。此外，上述 組合物還均包含對HBV檢測無干擾的具有堿基序列SEQIDNO. 10的內(nèi)標探針，或者其反向 互補序列。該內(nèi)標探針的一個末端標記熒光基團，且該內(nèi)標探針的另一個末端標記淬滅基 團，其中所述內(nèi)標探針的上述一個末端標記的熒光基團為FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、 TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一種，但并不限于上述幾種，且該內(nèi)標探針所標記的熒 光基團不同于用于檢測HBV核酸的探針末端所標記的熒光基團。
[0018] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種用于特異性檢測HBV核酸的試劑盒，其含有本發(fā) 明的上述至少一種引物組和/或上述至少一種探針。具體為，該試劑盒包含至少一種選自 以下所述的引物組：
[0019] (1)引物組1，其包含具有SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0020] (2)引物組2,其包含具有SEQIDN0. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 4 所示的核苷酸序列的引物；和
[0021] (3)引物組3,其包含具有SEQIDN0. 5所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDN0. 6 所示的核苷酸序列的引物。
[0022] 該試劑盒還包含至少一種選自以下的探針，或者包含至少一種以下序列的反向互 補序列：（1)探針1，其具有如SEQIDN0. 7所示的核苷酸序列；和
[0023] (2)探針2,其具有如SEQIDN0. 8所示的核苷酸序列；和
[0024] (3)探針3,其具有如SEQIDN0. 9所示的核苷酸序列；
[0025] 以上所述探針的一個末端標記熒光基團，且另一個末端標記淬滅基團，其中熒光 基團為FAM、R0X、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXASRED、VIC和TET中的任一種，但并 不限于上述幾種；