積，4μΜ的正向引物1體積，4μΜ的反向引物1體積，4μΜ的探針的體積 0.5體積，5UAU的熱啟動(dòng)Taq聚合酶0.2體積，其余為純水；所述PCR緩沖液包括100mM的 Tris-HCl 和 500mM 的 KC1;所述 dNTPs 試劑包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP。
[0037]上述各反應(yīng)體系的組分中還包括DNA模板；所述DNA模板的用量為0.5體積，所述 DNA模板的使用濃度為10~50ngAU。
[0038]上述探針a、探針b和探針c的5'端設(shè)有相互區(qū)別的報(bào)告熒光基團(tuán)。所述相互區(qū)別的 報(bào)告熒光基團(tuán)有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3,第三種是Cy5或R0X;所述 淬滅熒光基團(tuán)是BHQ1。
[0039] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種采用上述檢測(cè)體系的 SEPT9基因甲基化檢測(cè)試劑盒。
[0040] 本發(fā)明具有積極的效果：
[0041]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中：1)正向引物a和反向引物a針對(duì)未經(jīng)亞硫酸鹽處理的模板 進(jìn)行針對(duì)管家基因的引物和探針設(shè)計(jì)；2)正向引物b和反向引物b針對(duì)SEPT9啟動(dòng)子甲基化 檢測(cè)區(qū)域上下游約200bp范圍內(nèi)進(jìn)行設(shè)計(jì)，且針對(duì)的模板為經(jīng)過亞硫酸鹽處理的模板;3)探 針c針對(duì)SEPT9啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)區(qū)域，模板此處的CG如果變了，就表示SEPT9啟動(dòng)子沒有被 甲基化，探針也結(jié)合不上去；如果此處的CG沒變，探針可以結(jié)合上去，在形成擴(kuò)增產(chǎn)物過程 中當(dāng)Taq聚合酶擴(kuò)增到探針結(jié)合模板的位點(diǎn)時(shí)，其5 ' -3 '核酸外切酶活性切割掉探針5 '端的 報(bào)告基團(tuán)，游離的報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，打破能量的傳遞，激發(fā)報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào) 就可以被熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。這樣每擴(kuò)增一條DNA鏈，就對(duì)應(yīng)有一個(gè)游離的熒光分子(報(bào) 告基團(tuán)）形成，就會(huì)發(fā)一次光，保證了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而可以檢 測(cè)到甲基化情況;4)本試劑盒所述探針均為Taqman探針，探針較長使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)， 會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也會(huì)產(chǎn)生不同波長的熒光，都會(huì)使得未參與反應(yīng)的 探針本底偏高。基于此，本發(fā)明特別設(shè)計(jì)只在5'端帶淬滅基團(tuán)的探針d，且探針d為探針c的 一部分，其中最優(yōu)選的方案是探針d的3'端即為探針c的5'端;在傳統(tǒng)三步法PCR的基礎(chǔ)上， 增加低退火溫度(52°C，3s)這一步驟有利于未結(jié)合到模板上的探針c與探針d能完全結(jié)合， 可進(jìn)一步消除熒光背景干擾，即利用了低退火溫度有利于短片段的結(jié)合。傳統(tǒng)PCR三步法中 較高退火溫度(60°C，15s)時(shí)不利于短片段的結(jié)合，而利于長探針與模板的結(jié)合。探針b位于 正向引物b和反向引物b所覆蓋的模板區(qū)間內(nèi)，探針a、b、c、d需滿足一般探針設(shè)計(jì)原則;5)因 各反應(yīng)不在同一管內(nèi)進(jìn)行，探針a、b、c的報(bào)告熒光基團(tuán)可以采用同一種。
[0042]本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒采用熒光定量法，全程利用簡(jiǎn)單PCR反應(yīng)而非傳統(tǒng)復(fù)雜的巢 式PCR反應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)密的質(zhì)量控制，層層把控，確保模板DNA的硫化修飾質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)高通量、高 靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測(cè)。具有以下特點(diǎn)：1)進(jìn)行基因組DNA質(zhì)量分析的檢測(cè)體系X，利用簡(jiǎn) 單PCR反應(yīng)來控制模板質(zhì)量，排除了對(duì)結(jié)果分析的干擾因素;2)采用轉(zhuǎn)化液質(zhì)量分析的檢測(cè) 體系Y，并巧妙設(shè)立98%的陽性對(duì)照(含2%待檢測(cè)基因組DNA)，利用簡(jiǎn)單PCR反應(yīng)來保證甲 基化轉(zhuǎn)化效率;也可參照98%的轉(zhuǎn)化率判定方法，若需要同理經(jīng)實(shí)驗(yàn)也可推定其它轉(zhuǎn)化率 如99%的判定步驟;3)進(jìn)行甲基化檢測(cè)分析的檢測(cè)體系Z，多加了一條帶有淬滅基團(tuán)的探針 d，探針d為長探針c的一部分，有效消除長探針c自帶的熒光背景，進(jìn)一步保證了檢測(cè)體系Z 的甲基化檢測(cè)分析的準(zhǔn)確性，靈敏度極高；同時(shí)，試劑盒在使用時(shí)在傳統(tǒng)三步PCR基礎(chǔ)上，增 加在較低退火溫度收集熒光信號(hào)這一步驟，使增加的這一條帶淬滅基團(tuán)的探針能更好去除 未參與反應(yīng)的探針c的背景色。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是準(zhǔn)確，高通量，高敏感性的SEPT9基因 CpG島甲基化檢測(cè)產(chǎn)品，可適應(yīng)臨床的廣泛需求。
【附圖說明】
[0043]圖1是采用反應(yīng)體系X檢測(cè)樣本A1及其轉(zhuǎn)化液Ml的擴(kuò)增圖；
[0044] 圖2是采用反應(yīng)體系Z檢測(cè)陰性對(duì)照C、陽性對(duì)照E和樣本A1的轉(zhuǎn)化液Ml的擴(kuò)增圖；
[0045] 圖3是采用反應(yīng)體系X檢測(cè)陽性對(duì)照D、樣本A2及其轉(zhuǎn)化液M2的擴(kuò)增圖；
[0046] 圖4是采用反應(yīng)體系Y檢測(cè)陽性對(duì)照D、樣本A2的轉(zhuǎn)化液M2的擴(kuò)增圖；
[0047] 圖5是采用反應(yīng)體系Z檢測(cè)陰性對(duì)照C、陽性對(duì)照E和樣本A2的轉(zhuǎn)化液M2的擴(kuò)增圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 一、試劑盒的組成。
[0051 ]本實(shí)施例的SEPT9基因甲基化檢測(cè)試劑盒包括混合液X、混合液Y、混合液Z和熱啟 動(dòng)酶(Taq Hotstar)?；旌弦篨、混合液Y、混合液Z和熱啟動(dòng)酶(Taq Hotstar)分別置于不同 的試管中，如表1至表3所示。
[0052] 表1混合液X的組分表
[0053]
[0055] _
[0056] -
[0057] 表3混合液Z的組分表
[0058]
[0059] 引物和探針的核苷酸序列如表4所示。
[0060] 表4引物和探針的核苷酸序列表
[0061]
[0062]~混合液X中包括引物探針組X，混合液Y中包括引物探針組Y，混合液Z中包括引物探_ 針組Z。引物探針組X針對(duì)管家基因 GAPDH的序列設(shè)計(jì)且用于檢測(cè)未轉(zhuǎn)化DNA。引物探針組Y針 對(duì)MGMT啟動(dòng)子甲基化區(qū)域的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)且用于檢測(cè)已轉(zhuǎn)化的DNA。
[0063]其中，正向引物a、反向引物a和探針a是針對(duì)人類GAPDH基因設(shè)計(jì)。探針a的5'端設(shè) 有R0X修飾(報(bào)告熒光基團(tuán)），探針a的3 '端設(shè)有BHQ1修飾(淬滅熒光基團(tuán)）。探針b的5 '端設(shè)有 Hex修飾(報(bào)告熒光基團(tuán)），探針b的3'端設(shè)有BHQ1修飾(淬滅熒光基團(tuán)）。探針c的5'端設(shè)有 FAM修飾(報(bào)告熒光基團(tuán)），探針c的3 '端設(shè)有BHQ1修飾(淬滅熒光基團(tuán)）。探針d的5 '端沒有設(shè) 報(bào)告熒光基團(tuán)，探針d的3 '端設(shè)有BHQ1修飾(淬滅熒光基團(tuán)）。
[0064] PCR緩沖液（PCR 8葉€6〇、(1町？8、]\^(：12和熱啟動(dòng)酶來自了31^^公司（貨號(hào)： R007A)〇
[0065] 二、試劑盒的使用方法。
[0066]本實(shí)施例的SEPT9基因甲基化檢測(cè)試劑盒的具體檢測(cè)步驟如下：
[0067] 1、DNA 提取。
[0068] 米用試劑盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep c_kit)提取樣本DNA， 具體的操作參見試劑盒產(chǎn)品說明書。
[0069] 2、樣本DNA質(zhì)量檢測(cè)。
[0070] 獲得樣本DNA后，使用微量分光光度計(jì)測(cè)量濃度，通過測(cè)定濃度和0D260/0D280的 比值控制樣本質(zhì)量，最終加入反應(yīng)體系中的樣本濃度為lOOng/μΙ，1.9 2 A260/280 2 1.8， A260/230 2 1.0。合格的樣本DNA液即為樣本A，-20°C保存。
[0071] 3、甲基化處理。
[0072]采用甲基化處理試劑盒（EZ DNA methylation-Gold Kit，ZYM0 RESEARCH，美國， 產(chǎn)品編號(hào)：5005)對(duì)樣本進(jìn)行亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化，具體步驟參照甲基化試劑盒說明書，得到 轉(zhuǎn)化液M。
[0073] 4、準(zhǔn)備樣本及對(duì)照品。
[0074]各樣本及對(duì)照品具體成分如表5所示。
[0075]表5樣本及對(duì)照品說明
[0076]
[0077