一種培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種無血清培養(yǎng)基及其制備方法，具體涉及一種培養(yǎng)Marc-145細胞用 的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 猴胚胎腎上皮細胞(Marc-145)是上皮樣細胞，來源于猴腎細胞，從母細胞(MA104 細胞)克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。Marc-145細胞主要用于病毒的培養(yǎng)，特別是豬繁殖與 呼吸障礙綜合病毒(PRRSV)對此細胞尤為敏感。
[0003] 豬繁殖與呼吸障礙綜合征是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)引起，以成 年豬生殖障礙、早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎，以及仔豬呼吸異常為特征的傳染病，是一種免疫抑制病， 常常繼發(fā)其他病原感染。目前，該病在全世界幾乎所有養(yǎng)豬地區(qū)都已流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造 成了巨大的經(jīng)濟損傷。我國高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征的預防采用弱毒疫苗或者滅 活疫苗進行預防。PRRSV的增殖對細胞有嚴格的選擇性，其中Marc-145細胞對PRRSV敏感性 強，病毒可以達到很高的滴度，因而廣泛應用于高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的 滅活疫苗或者活疫苗生產(chǎn)。
[0004] 現(xiàn)有的Marc-145細胞培養(yǎng)過程中，通常需要加入8-10%的牛血清進行培養(yǎng)。如公 開號為CN102002482A的發(fā)明專利申請文件，公開了一種豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒的生 產(chǎn)方法，其中公開了細胞生長液的配方:體積百分含量為90-92 %的DMEM溶液、8-10 %的牛 血清、1 %的雙抗、1 %的谷氨酰胺;公開號為CN101748101A的發(fā)明專利申請文件，公開了一 種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的生產(chǎn)方法，其中公開了生長液為添加10%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。
[0005] 血清能為細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉(zhuǎn)移蛋白和其它營養(yǎng)物質(zhì)，但 其存在諸多缺點：批間差異較大，來源不穩(wěn)定，需要大量驗證工作，價格昂貴，成分不明確， 不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無血清培 養(yǎng)基是在基礎培養(yǎng)基的基礎上，加入血清替代成分，制備得到的培養(yǎng)基既能滿足細胞的培 養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。研發(fā)一種培養(yǎng)Marc-145細胞用的 無血清培養(yǎng)基，可有效降低后續(xù)病毒純化的分離難度，同時也可有效提高疫苗的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能促進Marc-145細胞快速生長和增殖，不含血清，動 物源成分含量低的培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 一種培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分:胰島素 樣生長因子0.1~lOyg/mL、表皮生長因子5~20yg/mL、成纖維生長因子0.1~10yg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋 白5~20yg/mL、亞硒酸鈉20~30yg/mL、小麥蛋白酶解物1~5mg/mL、1~5%體積百分比的酶解明 膠溶液和乙醇胺1 〇~20yg/mL。
[0008]優(yōu)選地，本發(fā)明提供的培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基，還 包括如下組分:胰島素樣生長因子5yg/mL、表皮生長因子10yg/mL、成纖維生長因子8yg/mL、 轉(zhuǎn)鐵蛋白15yg/mL、亞硒酸鈉25yg/mL、小麥蛋白酶解物4mg/mL、2%體積百分比的酶解明膠溶 液和乙醇胺15yg/mL。
[0009] 本發(fā)明所述的基礎培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基中的一種或兩 種。優(yōu)選地，所述的基礎培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基，其體積比為1:1。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述酶解明膠溶液為胰酶酶解明膠溶液，所述PBS溶液用超純水配 制而成。
[0011] 相應地，本發(fā)明還提供所述的培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基的制備方法， 包括如下步驟： S1:制備小麥蛋白酶解物； S2:制備酶解明膠溶液； S3:向基礎培養(yǎng)基中，按所述濃度加入胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維生長 因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、小麥酶解植物蛋白、酶解明膠溶液和乙醇胺，混勻，過膜除菌即 得培養(yǎng)基。
[0012] 優(yōu)選地，所述小麥蛋白酶解物的制備方法包括如下步驟:取小麥蛋白粉，加入其重 量15~20倍量純化水，攪拌均勻，混懸液中加入8~10mol/LHCL調(diào)節(jié)溶液pH值為2.0~4.0，加 入1200~1800U/g的酶，35~45°C下酶解6~10h，用1~2mol/LHCL或NaOH保持溶液pH值不變，酶 解結(jié)束后95°C滅酶15~20min，冷卻后離心取上清液，減壓濃縮，減壓干燥，即得小麥蛋白酶 解物。
[0013]本發(fā)明所述的酶解小麥蛋白的酶選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋 白酶中的一種或多種。優(yōu)選地，所述的酶解小麥蛋白的酶為胃蛋白酶。
[0014] 優(yōu)選地，所述酶解明膠溶液的制備方法包括如下步驟： S1:將明膠溶解在PBS溶液中，得到明膠PBS溶液，所述明膠PBS溶液的質(zhì)量體積濃度為 200-400mg/mL； S2:將S1得到的明膠PBS溶液進行濕熱高壓滅菌處理，所述濕熱高壓滅菌處理的溫度為 121°C、壓力為 103.4KPa、時間為 20min; S3:將經(jīng)S2處理后的明膠roS溶液冷卻至常溫，加入其體積0.5~2%的質(zhì)量百分濃度為 0.25 %的胰酶溶液，在37°C溫度下酶解24~36h; S4:將經(jīng)S3處理后的明膠PBS溶液冷卻至2-8°C，如出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，則重復S3步驟，直至 在2-8°C時無凝固現(xiàn)象出現(xiàn)，得到酶解明膠溶液。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種新的培養(yǎng)Marc-145細 胞用的無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基能促進Marc-145 細胞快速生長和增殖，同時，與傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明培養(yǎng)Marc-145細胞用的培 養(yǎng)基不含血清，動物源成分含量低，有效降低了后續(xù)病毒的純化帶來分離難度，同時也提高 了疫苗的安全性。此外，本發(fā)明的制備方法簡單、易操作，便于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0017]實施例1本發(fā)明培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基 一種培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基，其包括MEM培養(yǎng)基，還包括如下組分:胰島 素樣生長因子2yg/mL、表皮生長因子5yg/mL、成纖維生長因子8yg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白5yg/mL、亞 硒酸鈉20yg/mL、小麥蛋白酶解物5mg/mL、5%體積百分比的酶解明膠溶液和乙醇胺1Oyg/mL。
[0018]制備方法： s1:取小麥蛋白粉，加入其重量15倍量純化水，攪拌均勻，混懸液中加入1Omo1/LHCL調(diào) 節(jié)溶液pH值為3.0，加入1800U/g的酸性蛋白酶，40°C下酶解8h，用2mol/LHCL或NaOH保持溶 液pH值不變，酶解結(jié)束后95°C滅酶20min，冷卻后離心取上清液，減壓濃縮，減壓干燥，即得 小麥蛋白酶解物； S2:將20g明膠溶解在90mL的roS溶液中，得到明膠roS溶液； S3:將S2得到的明膠PBS溶液進行濕熱高壓滅菌處理，所述濕熱高壓滅菌處理的溫度為 121°C、壓力為 103.4KPa、時間為 20min; S4:將經(jīng)S3處理后的明膠PBS溶液冷卻至常溫，加入10mL質(zhì)量百分濃度為0.25 %的胰酶 溶液，在37°C溫度下酶解36h; S5:將經(jīng)S4處理后的明膠PBS溶液冷卻至4°C，如出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，則重復S4步驟，直至在4 °C時無凝固現(xiàn)象出現(xiàn)，得到酶解明膠溶液； S6:向MEM培養(yǎng)基中，按所述濃度加入胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維生長因 子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、小麥酶解植物蛋白、酶解明膠溶液和乙醇胺，混勻，過膜除菌即得 本發(fā)明實施例1無血清培養(yǎng)基。
[0019]實施例2本發(fā)明培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基 一種培養(yǎng)Marc-145細胞用的無血清培養(yǎng)基，其包括DMEM培養(yǎng)基，還包括如下組分： 胰島素樣生長因子lyg/mL、表皮生長因子18yg/mL、成纖維生長因子8yg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白 15yg/mL、亞硒酸鈉28yg/mL、小麥蛋白酶解物lmg/mL、2%體積百分比的酶解明膠溶液和乙醇 胺15yg/mL。
[0020] 制備方法： S1:取小麥蛋白粉，加入其重量20倍量純化水，攪拌均勻，混懸液中加入10mol/LHCL調(diào) 節(jié)溶液pH值為2.0，加入500U/g的酸性蛋白酶和1000U/g的胃蛋白酶，42°C下酶解8h，用 2mol/LHCL或NaOH保持溶液pH值不變，酶解結(jié)束后95°C滅酶20min，冷卻后離心取上清液， 減壓濃縮，減壓干燥，即得小麥蛋白酶解物； S2:將30g明膠溶解在90mLPBS溶液中，得到明膠roS溶液； S3:將S2得到的明膠PBS溶液進行濕熱高壓滅菌處理，所述濕熱高壓滅菌處理的溫度為 121°C、壓力為 103.4KPa、時間為 20min; S4:將經(jīng)S3處理后的明膠PBS溶液冷卻至常溫，加入10mL質(zhì)量百分濃度為0.25 %的胰酶 溶液，在37°C溫度下酶解30h; S5:將經(jīng)S4處理后的明膠PBS溶液冷卻至8°C，如出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，則重復S4步驟，直至在8 °C時無凝固現(xiàn)象出現(xiàn)，得到酶解明膠溶液； S6:向DMEM培養(yǎng)基中，按所述濃度加入胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維生長 因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、小麥酶解