_80度。
[0047]實施案例三本發(fā)明細胞模型的建立
在本實驗中使用人肝癌細胞(Hep-G2 )為受體細胞。
[0048]使用的慢病毒為裝載GFP基因的慢病毒。
[0049]試驗過程如下:
(1)細胞培養(yǎng)
用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基接種細胞于35mm細胞培養(yǎng)皿，細胞濃度為6 X105/孔。待細胞完全貼壁后，用轉染試劑M40進行轉染。
[0050](2)感染過程
慢病毒用完全DMEM培養(yǎng)基(含6yg/ml polybrene)稀釋至合適倍數(shù)后，加入到棄去上清的Hep-G2細胞表面;慢病毒感染24h后，換用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0051 ] (3)細胞克隆化
取飼養(yǎng)細胞。實驗小鼠脫白致死，75%酒精浸泡lOmin，無菌解剖，剪開腹部皮膚，不要損傷腹膜，用注射器吸取6_8ml完全培養(yǎng)基，用鑷子夾起腹膜，進針，注意不要戳到內(nèi)臟和脂肪，進針方位可以在腹部中間，避開腹部下方的脂肪。
[0052]反復吹打腹腔數(shù)次，期間用酒精棉球輕揉小鼠腹部，待吸出培養(yǎng)基變黃時將培養(yǎng)基吸出，轉移到離心管內(nèi)備用。(一只成年小鼠的腹腔巨噬細胞可以滿足6-8塊96孔細胞培養(yǎng)板的鋪板需要)。
[0053]取感染后Hep_G2細胞，消化，計數(shù)，每20ml培養(yǎng)基(含相應濃度的飼養(yǎng)細胞)加入150個細胞，分96孔板，200μ1/孔。
[0054]細胞培養(yǎng)1天后觀察是否有污染，培養(yǎng)3-5天后計數(shù)細胞亞克隆數(shù)目，并做記錄。細胞培養(yǎng)10天，選擇單克隆細胞孔在熒光顯微鏡下進行觀察，選擇發(fā)綠色熒光的細胞克隆進行消化和擴大培養(yǎng)。
[0055]實施案例四陽性克隆細胞的篩選和細胞迀移體系建立
由于外源基因隨機整合到宿主細胞的染色體上，根據(jù)整合位點的隨機性，可能存在宿主細胞狀態(tài)差、對信號分子反應弱和目的基因表達穩(wěn)定性差等問題。因此將所有挑出的陽性克隆細胞擴大培養(yǎng)后，進行細胞生長曲線對比試驗和GFP表達穩(wěn)定性分析。
[0056]試驗例一 GFP表達穩(wěn)定性分析
在本實驗中共篩選得到了 4個陽性克隆。對這4個陽性克隆進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)試驗方案:細胞匯合度達到80%時，棄去細胞上清，用D-PBS洗滌一遍，加入適量胰酶進行消化，倒置顯微鏡下觀察，待大部分細胞變?yōu)閳A形時使用有血清有抗生素的完全DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹下細胞，lOOOrpm離心10分鐘，留1/4的細胞在原培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%時重復上述操作。
[0057]每傳代5次，熒光顯微鏡下觀察熒光細胞的比例和細胞的熒光強度，拍照記錄。結果如圖2所示:Hep-G2-GFP細胞系在第30代時其熒光率仍然保持100%，證明Hep-G2-GFP細胞系具有良好的穩(wěn)定性。
[0058]試驗例二本發(fā)明細胞模型與野生型細胞生長曲線比較
從上部試驗篩選獲得的4株細胞中選擇細胞生長狀態(tài)最好的1株，對這株細胞與野生型Hep_G2細胞進行擴大培養(yǎng)，待細胞數(shù)量達到一定規(guī)模時進行生長曲線分析。生長曲線分析試驗方案:細胞匯合度達到80%時進行細胞消化和計數(shù)，按照1.5 X 103/孔的細胞密度鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，每組設立3個復孔，使用有血清有抗生素的完全DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每孔200μ1，分別在24h，48h，72h，96h，120h和144h進行細胞活力分析，具體步驟為:棄去細胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基ΙΟΟμΙ，37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后，取出細胞，在酶標儀0D450條件下進行讀數(shù)，對結果進行分析，結果如圖3所示:Hep-G2-GFP細胞系與野生型Hep-G2細胞系生長曲線基本一致，證明Hep-G2_GFP細胞系具有良好的生長活性。
[0059]試驗例三本發(fā)明細胞模型與野生型細胞在HGF作用下細胞迀移效應比較
試驗例一和試驗例二證明我們篩選獲得的細胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長曲線與野生型一致，是良好的穩(wěn)轉細胞株。
[0060]試驗例三從生物學活性角度分析本發(fā)明細胞模型是否具有由HGF引起的細胞迀移效應，以及這種效應與野生型Hep-G2細胞的比較。HGF是肝細胞生長因子，其能夠促進野生型Η印-G2細胞的細胞迀移效應。
[0061 ]細胞迀移效率計算公式為:
細胞迀移效率=給藥孔的迀移細胞數(shù)+不含藥孔的迀移細胞數(shù)其中不含藥孔的細胞迀移效率定為1.0。
[0062]試驗方案:
1)細胞分孔:細胞匯合度達到80%時進行細胞消化和計數(shù)，將細胞用低血清(1%FBS)DMEM培養(yǎng)基稀釋至目標濃度，加入小室內(nèi)，0.5ml/well，5 X 104cell/well，貼壁培養(yǎng)；
2)加藥:加入含100ng/ml濃度的HGF至小室下層，HGF使用低血清(1%FBS)DMEM培養(yǎng)基進行稀釋，0.75ml/well;
3)培養(yǎng):37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h;
5)洗滌:取出小室，棄去培養(yǎng)基，PBS0.5mlol time，RT;
6)固定:小室內(nèi)加入甲醛，0.5ml，10min，RT;
7)擦拭:取出小室，用棉簽擦掉小室上層細胞，并用PBS淋洗一次；
8)染色:結晶紫染色液置于24孔板0.5ml，將小室置于其中，>30min，RT(步驟8_9為野生型！fep-G2細胞操作步驟，本發(fā)明細胞模型無需染色，直接在熒光顯微鏡下觀察)
9)洗滌:大量自來水置于500ml燒杯中，漂洗小室；
10)成像計數(shù):顯微鏡下成像，計數(shù)。
[0063]結果分析
結果如圖4和圖5所示:
A為明場條件下HGF作用下Hep-G2-GFP細胞系迀移照片；
B為熒光場條件下HGF作用下Hep-G2-GFP細胞系迀移照片，圖A與圖B為同一區(qū)域不同光場下照片；
C為熒光場條件下無HGF作用下Hep-G2-GFP細胞系迀移照片；
D為明場下野生型Hep-G2細胞系在HGF作用下細胞迀移照片(經(jīng)結晶紫染色)；
圖5為Hep-G2-GFP細胞系與野生型Hep-G2細胞系在HGF作用下細胞迀移效應比較；
B與A比較，細胞分辨率明顯升高，B與D比較，細胞分辨率沒有顯著差異，證明Hep-G2-GFP細胞系在無需染色的情況下即可達到野生型Hep-G2細胞系經(jīng)結晶紫染色后的細胞分辨率。
[0064]圖5:Hep-G2-GFP細胞系與野生型Hep_G2細胞系比較，在HGF作用下細胞迀移效應更加顯著，證明Hep-G2-GFP細胞系具有良好的生物學活性。
[0065]
試驗例四Hep-G2-GFP細胞系在不同濃度HGF作用下的細胞迀移效應及細胞活性分析試驗例一和試驗例二證明我們篩選獲得的細胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長曲線與野生型細胞一致，是良好的穩(wěn)轉細胞株。試驗例三從生物學活性角度分析本發(fā)明細胞模型具有與野生型Η印-G2細胞一致的對HGF敏感的細胞迀移效應。
[0066 ] 試驗例四通過加入不同濃度的HGF，分析不同濃度HGF引起的細胞迀移效應以及細胞活性分析。
[0067]細胞迀移效應試驗方案:分別在小室下部加入不同濃度的HGF。
[0068]細胞活性分析試驗方案:細胞匯合度達到80%時進行細胞消化和計數(shù)，按照5X103/孔的細胞密度鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，每組設立3個復孔，使用含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每孔200μ1，次日加入含不同濃度HGF的1% FBS的DMEM，加藥后72h時進行細胞活力分析，具體步驟為:棄去細胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基100μ?，37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后，取出細胞，在酶標儀0D450條件下進行讀數(shù)，