對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，
結(jié)果如圖6所不:
A為Hep-G2-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下的細(xì)胞迀移數(shù)量，其中橫坐標(biāo)為HGF濃度(HGF: ng/ml),縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞數(shù)量)。HGF濃度在100ng/ml時(shí)Hep-G2_GFP細(xì)胞系的細(xì)胞迀移效應(yīng)最顯著，因此選擇此濃度建立抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法。
[0069]B為Hep-G2_GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下細(xì)胞活性，其中橫坐標(biāo)為HGF濃度(HGF: ng/ml)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(ODASOXHep-GS-GFP細(xì)胞系在不同濃度HGF作用下的細(xì)胞活性無(wú)變化，證明HGF對(duì)Hep-G2-GFP細(xì)胞系增殖活性沒(méi)有影響。
[0070]試驗(yàn)例五Η印-G2-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞迀移效應(yīng)及細(xì)胞活性分析
試驗(yàn)例一和試驗(yàn)例二證明我們篩選獲得的細(xì)胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長(zhǎng)曲線與野生型細(xì)胞一致，是良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。試驗(yàn)例三從生物學(xué)活性角度分析本發(fā)明細(xì)胞模型具有與野生型Η印-G2細(xì)胞一致的對(duì)HGF敏感的細(xì)胞迀移效應(yīng)。
[0071]試驗(yàn)例五通過(guò)加入HGF抑制劑PF04217903，分析PF04217903對(duì)HGF引起細(xì)胞迀移效應(yīng)的抑制效應(yīng)。？^)4217903是一種選擇性的4了?競(jìng)爭(zhēng)性(3-]^丨抑制劑，1050為4.8 ηΜ。
[0072]細(xì)胞迀移效應(yīng)試驗(yàn)方案:分別在小室上部加入不同濃度的PF04217903，小室下部加入100 ng/ml的HGF。對(duì)照為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組。
[0073]細(xì)胞活性分析試驗(yàn)方案:參照試驗(yàn)例四步驟，分別加入不同濃度的PF04217903和100 ng/ml的HGF。對(duì)照為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組。
[0074]結(jié)果如圖7所示:
A為Hep-G2-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞迀移數(shù)量，其中橫坐標(biāo)為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標(biāo)為迀移細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞數(shù)量)，對(duì)照為不含HGF，不含PF04217903對(duì)照組。其他各組均含有100ng/ml的邪？。邪?濃度在100即/1111時(shí)，不同濃度PF04217903對(duì)HGF引起的Η印-G2-GFP細(xì)胞系的細(xì)胞迀移效應(yīng)完全抑制。
[0075]B為Hep-G2_GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903作用下的細(xì)胞活性，其中橫坐標(biāo)為PF04217903濃度(PF04217903: μΜ)，縱坐標(biāo)為450nm單波長(zhǎng)條件下測(cè)定的光度吸收值(ODASOXHep-GS-GFP細(xì)胞系在不同濃度PF04217903和100 ng/ml的HGF共同作用下的細(xì)胞活性無(wú)變化，證明PF04217903對(duì)Η印-G2-GFP細(xì)胞系增殖活性沒(méi)有影響。
[0076]試驗(yàn)例六基于上述細(xì)胞模型的藥物篩選方法的確定
(1)細(xì)胞接種密度
為了檢驗(yàn)不同細(xì)胞接種密度對(duì)抗細(xì)胞迀移藥物篩選體系的影響，尋求一個(gè)最適的細(xì)胞接種密度。分別接種2.5 X 104，5 X 104，1 X 105，2 X 105/孔的細(xì)胞于transwell小室，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。參照試驗(yàn)例三的細(xì)胞迀移試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，分析細(xì)胞迀移效率。
[0077]試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示:
A圖顯示細(xì)胞接種密度為2.5 X 104和5 X 104時(shí)，細(xì)胞迀移效率明顯高于1 X 105和2 X105，B圖顯示5 X 104組迀移細(xì)胞數(shù)量明顯高于2.5 X 104組，綜合考慮，選擇5 X 104/孔作為篩選體系的細(xì)胞接種密度。
[0078](2)細(xì)胞孵育時(shí)間
為了檢驗(yàn)不同細(xì)胞孵育時(shí)間對(duì)抗細(xì)胞迀移藥物篩選體系的影響，尋求一個(gè)最適的細(xì)胞孵育時(shí)間。分別在細(xì)胞接種4，6，8，10，24h后進(jìn)行迀移細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。參照試驗(yàn)例三的細(xì)胞迀移試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，分析細(xì)胞迀移效率。
[0079]試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示:
A圖顯示細(xì)胞孵育時(shí)間為24h時(shí)，細(xì)胞迀移效率高于其他組，B圖顯示細(xì)胞孵育時(shí)間為24h時(shí)，迀移細(xì)胞數(shù)高于其他組，綜合考慮，選擇24h作為篩選體系的細(xì)胞孵育時(shí)間。
[0080]
(3 )不同濃度DMS0對(duì)藥物篩選方法的影響
抗細(xì)胞迀移藥物可能溶于DMS0。因此有必要檢測(cè)不同濃度DMS0對(duì)藥物篩選方法的影響。
[0081 ]細(xì)胞迀移效應(yīng)試驗(yàn)方案:分別在小室上部加入不同濃度的DMS0，小室下部加入100ng/ml的HGF。對(duì)照為不含HGF，不含DMS0對(duì)照組。
[0082]細(xì)胞活性分析試驗(yàn)方案:參照試驗(yàn)例四步驟，分別加入不同濃度的DMS0和100 ng/ml的HGF ο對(duì)照為不含HGF，不含DMS0對(duì)照組。
[0083]試驗(yàn)結(jié)果如圖10所示:
A圖顯示不同濃度的DMS0對(duì)HGF引起的細(xì)胞迀移效率沒(méi)有顯著影響，B圖顯示DMS0濃度為0.5%時(shí)，細(xì)胞活性略有下降，DMS0濃度為1%和2%時(shí)，細(xì)胞活性顯著下降，考慮到加藥濃度，篩選體系最終含有的DMS0濃度不會(huì)高于0.1%，因此DMS0對(duì)篩選體系沒(méi)有顯著影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述細(xì)胞模型是克隆了GFP基因的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞;所述哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞可選但不限于HepG2、MCF-7、U-87-MG、MDA-MB-231中的一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述GFP基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述GFP基因序列為SEQ ID NO: Ιο4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于:所述細(xì)胞模型由慢病毒系統(tǒng)制備完成，包括以下步驟:將GFP基因克隆至prrl質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建成prrl-CMV-GFP重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞，收獲純化病毒，病毒感染對(duì)數(shù)期細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法和熒光篩選，獲得本發(fā)明所述的細(xì)胞模型。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于與親本細(xì)胞系相比具有類(lèi)似的生長(zhǎng)曲線。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤迀移藥物的細(xì)胞模型，其特征在于在細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中，HGF引起的細(xì)胞迀移效應(yīng)顯著，特異性小分子抑制劑對(duì)HGF引起的細(xì)胞迀移效應(yīng)抑制效應(yīng)顯著，以上生物學(xué)活性與親本細(xì)胞系一致。7.—種細(xì)胞迀移篩選模型的方法，其特征在于包括以下步驟: a.取上述的用于篩選的細(xì)胞模型接種于transwell小室內(nèi)，其中篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養(yǎng)基，下室加入含促細(xì)胞迀移藥物的維持培養(yǎng)基； b.細(xì)胞孵育4-24h，細(xì)胞固定后，無(wú)菌棉簽擦掉上室細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下表面4個(gè)固定視野區(qū)域的迀移細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)迀移細(xì)胞數(shù)量確定待篩選物是否為需要的潛在藥物。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種表達(dá)綠色熒光蛋白的哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系的制備方法和應(yīng)用，該細(xì)胞系與親本細(xì)胞系相比具有類(lèi)似的生長(zhǎng)曲線，在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，HGF引起的細(xì)胞遷移效應(yīng)顯著，小分子特異性抑制劑對(duì)HGF引起的細(xì)胞遷移效應(yīng)抑制效應(yīng)顯著，以上生物學(xué)活性與親本細(xì)胞系一致。本發(fā)明制備的細(xì)胞模型，是將綠色熒光蛋白（GFP）基因通過(guò)慢病毒感染的方式插入哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系的基因組內(nèi)，獲得的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞系，該細(xì)胞模型在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)直接熒光顯微鏡觀察的方式來(lái)顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，簡(jiǎn)化了該細(xì)胞模型應(yīng)用于高通量藥物篩選的步驟。
【IPC分類(lèi)】C12R1/91, C12N5/10, C12Q1/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105462932
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511002009
【發(fā)明人】蔣明, 靳令經(jīng), 尹衍新
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院, 上海市同濟(jì)醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年12月29日