一種硼替佐米誘導(dǎo)海洋真菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種真菌代謝領(lǐng)域添加表觀修飾劑進(jìn)行誘導(dǎo)的方法，具體是一種硼替佐米誘導(dǎo)海洋真菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法，即使用硼替佐米誘導(dǎo)海洋真菌Pestalot1psis maculans合成常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)法合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著國(guó)家對(duì)海洋資源的重視和開(kāi)發(fā)，有關(guān)海洋真菌活性代謝產(chǎn)物的研究報(bào)告層出不窮。其中，很多海洋真菌的代謝產(chǎn)物被證明具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌和防治心血管疾病的活性，成為相關(guān)藥物研制中重要的先導(dǎo)化合物。
[0003]隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，高通量基因組測(cè)序結(jié)果顯示，真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于目前所分離到的次級(jí)代謝產(chǎn)物的數(shù)量。真菌在表達(dá)次級(jí)代謝產(chǎn)物過(guò)程中的表觀抑制現(xiàn)象非常明顯，大部分代謝產(chǎn)物的生物合成基因在普通實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下處于沉默狀態(tài)。所以，通過(guò)使用表觀修飾劑激活沉默基因使其進(jìn)行表達(dá)，將有利于豐富海洋真菌代謝產(chǎn)物的多樣性，乃至提高分離得到海洋真菌新穎代謝產(chǎn)物的效率。硼替佐米是臨床上廣泛應(yīng)用的一種蛋白酶體抑制劑，屬于表觀修飾劑的一種。2014年\^11(16—01611 KM等人首次報(bào)道了其能夠誘導(dǎo)植物落葉中真菌產(chǎn)生新化合物的作用(VanderMo 1 en KM，e tal.Epigenetic manipulat1n of a filamentous fungus by the proteasome —inhibitor bortezomib induces the product1n of an addit1nal secondarymetabolite.RSC advances.2014;4(35): 18329-18335.)。本發(fā)明將硼替佐米應(yīng)用在海洋真菌Pestalot1psis maculans的發(fā)酵過(guò)程中，檢測(cè)到了實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)條件下無(wú)法產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服海洋真菌常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下沉默基因不表達(dá)、代謝產(chǎn)物不豐富的缺點(diǎn)，提供一種硼替佐米誘導(dǎo)海洋真菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法，特別是提供一種使用硼替佐米誘導(dǎo)海綿共生真菌Pestalot1psis maculans合成次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用及方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]第一方面，本發(fā)明提供一種硼替佐米在誘導(dǎo)海洋真菌合成次生代謝產(chǎn)物中的用途
[0007]優(yōu)選地，所述海洋真菌為海綿共生斑污擬盤(pán)多毛孢真菌。
[0008]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述所述海洋真菌為海綿共生真菌為斑污擬盤(pán)多毛孢(Pestalot1psis maculans)16F-12。
[0009]在上述第一方面所述內(nèi)容中，硼替佐米的作用是作為誘導(dǎo)劑。
[0010]第二方面，本發(fā)明提供一種用硼替佐米誘導(dǎo)海洋真菌合成次生代謝產(chǎn)物的方法，所述方法具體為在海洋真菌發(fā)酵過(guò)程中添加硼替佐米，即可。
[0011]優(yōu)選地，所述發(fā)酵包括將所述海洋真菌接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得種子液的步驟和將所述種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵得到次生代謝產(chǎn)物的步驟。
[0012]優(yōu)選地，所述硼替佐米的添加時(shí)間為:種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基24小時(shí)后添加，此時(shí)，菌體在培養(yǎng)基中達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體子代充分可接受硼替佐米修飾。
[0013]優(yōu)選地，所述硼替佐米的添加量為:硼替佐米在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的的終濃度不低于300μΜ。
[0014]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述硼替佐米的添加量為:硼替佐米在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的的終濃度為300?ΙΟΟΟμΜ。
[0015]更優(yōu)選地，所述硼替佐米的添加量為:硼替佐米在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的的終濃度為300μΜ。
[0016]優(yōu)選地，所述硼替佐米的添加具體指加入硼替佐米母液。
[0017]進(jìn)一步地，所述硼替佐米母液的制備方法具體為:稱(chēng)取384.24mg硼替佐米溶于少量DMS0中，用容量瓶定量至1 OmL，得濃度為ImM的硼替佐米母液，備用。
[0018]優(yōu)選地，將所述海洋真菌接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得種子液的步驟中，所述接種采用接種環(huán);所述接種的量為1接種環(huán)，約含3 X 107個(gè)海洋真菌孢子；
[0019]所述培養(yǎng)的條件為:28°C，150rpm，48小時(shí);所述培養(yǎng)具體是指在搖床中實(shí)現(xiàn)的；
[0020]所述種子培養(yǎng)基的制備具體為:將30g馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)溶于1L人工海水，pH調(diào)至7.4，115°C高溫滅菌30min即得。
[0021]優(yōu)選地，將所述種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵得到次生代謝產(chǎn)物的步驟中，所述種子液的接種量為1 % (v/v)；
[0022]所述發(fā)酵的條件為:28°C，150rpm，8天;所述發(fā)酵具體是指在搖床中實(shí)現(xiàn)的；
[0023]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備具體為:向每1L人工海水中加入10g葡萄糖、20g甘露醇、20g麥芽糖、3g酵母膏、lg玉米楽，10g谷氨酸鈉，0.5g色氨酸，0.5g K2HP04，0.3g MgS(k.7Η2θ，ρΗ調(diào)至7.4，115°C高溫滅菌30min，即得。
[0024]優(yōu)選地，所述海洋真菌為海綿共生斑污擬盤(pán)多毛孢真菌。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述所述海洋真菌為海綿共生真菌為斑污擬盤(pán)多毛孢(Pestalot1psis maculans)16F-12。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)海洋真菌的條件相比，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加硼替佐米，明顯提高了海綿共生斑污擬盤(pán)多毛孢真菌代謝產(chǎn)物的合成水平。
【附圖說(shuō)明】
[0027]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0028]圖1為在海綿共生斑污擬盤(pán)多毛孢真菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同表觀修飾劑代謝產(chǎn)物的指紋圖譜的對(duì)比圖；
[0029]圖2為在海綿共生斑污擬盤(pán)多毛孢真菌發(fā)酵時(shí)添加不同濃度的硼替佐米時(shí)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物指紋圖譜的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]以下實(shí)施例中涉及的海洋真菌分離自中國(guó)南海永興島Phakelliafusca海綿，菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，其小亞基核糖體基因(18S rDNA)序列blast比對(duì)(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast)與最相似菌株斑污擬盤(pán)多毛抱 Pestalot1psismaculans(序列號(hào):AB220236)，相似度為99%，故可確定本海洋真菌為斑污擬盤(pán)多毛孢(Pestalot1psis maculans )，將其編號(hào)為16F-12，菌株的18S rDNA基因的序列號(hào)為KM972709o
[0032]實(shí)例1、確定最優(yōu)的表觀修飾劑
[0033]選擇三種表觀修飾劑伏立諾他(SAHA)、5_氮雜胞苷(5-Azacytidine)、硼替佐米(Bortizomib)作為誘導(dǎo)真菌沉默基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，從中確定最優(yōu)的誘導(dǎo)劑。
[0034]三種表觀修飾劑的配制如下:
[0035](1)伏立諾他溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取264.32mg伏立諾他