三萜皂苷類化合物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及三萜皂苷類化合物及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 三七Panax notoginseng為五加科植物三七的干燥根及根莖，另I」名山漆、金不換、 田漆、田三七、田七、參三七、血參、人參三七、滇三七等，主產(chǎn)于我國(guó)云南、廣西等地。本品性 溫，味甘、微苦，無(wú)毒。三七生品能消腫止痛，散瘀止血，熟品能補(bǔ)血活血。三七用于治療疾病 已有悠久的歷史，為我國(guó)常用的傳統(tǒng)名貴藥材之一。數(shù)千年來(lái)為中華民族的繁榮作出了巨 大的貢獻(xiàn)，并深受世界人民的關(guān)注與重視。
[0003] 如今現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，導(dǎo)致了傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的研究手段相對(duì)落后，從而 與現(xiàn)代科學(xué)理論相脫節(jié)，使三七的藥效資源開(kāi)發(fā)較局限。皂苷作為三七的主要藥效物質(zhì)成 分，往往很難以初級(jí)皂苷形式直接被人體吸收，而是要經(jīng)過(guò)人體代謝成次級(jí)皂苷尤其是稀 有人參皂苷，才能被吸收進(jìn)入血液，發(fā)揮藥效作用。
[0004] 生物轉(zhuǎn)化手段具有反應(yīng)較快、專屬性較強(qiáng)、副反應(yīng)較少的特點(diǎn)，利用了微生物體內(nèi) 復(fù)雜的酶系促使三七中原有的化學(xué)成分經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾或活性位點(diǎn)的改變，獲得活性更好、 毒性更小、藥用價(jià)值更大的先導(dǎo)化合物，用于新藥開(kāi)發(fā)，從而更好地發(fā)揮三七藥材資源優(yōu) 勢(shì)，開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥具有了十分重要的研究意義和社會(huì)效益。
[0005] 三七作為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，同人參一樣作為早期的藥食同源植物，素有"參中 之王"的美譽(yù)。具有多種藥效物質(zhì)成分及較強(qiáng)的藥理作用，已被廣泛開(kāi)發(fā)成多種產(chǎn)品用于臨 床疾病的治療。但是同時(shí)，三七作為一種傳統(tǒng)的中草藥，其中多種成分的用途都沒(méi)有被開(kāi)發(fā) 利用。三七皂苷為其主要的活性成分，但依據(jù)人參皂苷在體內(nèi)的代謝規(guī)律及其構(gòu)效關(guān)系可 知，"人參皂苷"是通過(guò)胃腸道吸收后被腸道菌逐級(jí)代謝為次級(jí)皂苷及苷元吸收進(jìn)入血液循 環(huán)后發(fā)揮藥理作用的，表明，天然人參皂苷結(jié)構(gòu)并不是結(jié)構(gòu)最佳狀態(tài)。綜上所述，如何通過(guò) 合理的結(jié)構(gòu)修飾手段，將三七中原有的含量較高的人參皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾轉(zhuǎn)化成低糖鏈或 新的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的稀有人參皂苷成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決上述問(wèn)題，提供了三萜皂苷類化合物及其制備方法和用途。
[0007] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種新的三萜皂苷類化合物。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供上述三萜皂苷類化合物作為制備抗腫瘤藥物的用途。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，提供一種上述三萜皂苷類化 合物的制備方法。
[0010] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
[0011] 化合物的結(jié)構(gòu)式為：
[0012]
[0013] 所述三萜皂苷類化合物為:6-(H3-D-吡喃葡萄糖基-達(dá)瑪-17β(Η)-20(22)(Ε)_烯-30，6a，120，24S，25-五醇。
[0014]進(jìn)一步的，所述的三萜皂苷類化合物是從三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中提取得到的。
[0015] 一種制備上述的三萜皂苷類化合物的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
[0016]步驟一:三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備：
[0017] A種子液制備：
[0018] 取靈芝種子培養(yǎng)液液體培養(yǎng)基于壓力蒸汽滅菌器中于121°C滅菌處理30分鐘，冷 卻后在無(wú)菌操作臺(tái)中接入斜面菌種，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于27~29°C，160轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)， 得澄清星芒狀菌球，即得種子液備用；
[0019] B轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備：
[0020] 取三七藥材粉末，加入碳酸鈣生長(zhǎng)因子和水，混勻，密封并滅菌，于室溫下冷卻，在 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)接入所述步驟A制備的所述種子液，避光培養(yǎng)，至容器底部布滿菌絲體為止， 取出干燥，即得三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
[0021] 步驟二:提?。?br>[0022] 取所述步驟B制備的所述三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，加入4-8倍重量份的70 %的乙醇，回流提 取3-5次，每次1-3小時(shí)，過(guò)濾并合并提取液，壓縮得稠膏；將所述稠膏加水分散并依次用等 體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇溶液萃取6~8次，后對(duì)萃取液分別減壓干燥，得石 油醚部分、乙酸乙酯部分和水飽和正丁醇部分；
[0023] 步驟三:分離純化：
[0024] 取所述步驟二制備的所述乙酸乙酯部分上硅膠柱色譜，以體積比100:0~0:100的 二氯甲烷-甲醇混合溶劑洗脫，薄層色譜檢識(shí)，收集二氯甲烷-甲醇=100:10部分洗脫液，合 并含所述三萜皂苷類化合物所述流分157~165的洗脫液，回收溶劑至干，所得物再經(jīng)反相 RP-C18柱層析，以體積比100:50的甲醇-水混合溶劑洗脫，減壓回收溶劑至干，得到含有所 述三萜皂苷類化合物粗品，再經(jīng)半制備型高效液相色譜分離純化，用58 %甲醇-水洗脫，即 甲醇與水得重量分?jǐn)?shù)比為58:42，到所述三萜皂苷類化合物純品。
[0025]進(jìn)一步的，所述靈芝種子培養(yǎng)液液體培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分:葡萄糖 為1 %~4%，蛋白胨為0.2%~1 %，酵母粉為0.1 %~0.3%，磷酸二氫鉀為0.1 %~0.3%， 硫酸鎂為ο. 1 %，水為95 %~99 %。
[0026]進(jìn)一步的，所述靈芝種子培養(yǎng)液液體培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分:葡萄糖 為2%，蛋白胨為0.5%，酵母粉為0.2%，磷酸二氫鉀為0.1%，硫酸鎂為0.1%，水為97.1%。 [0027]進(jìn)一步的，所述步驟B中：所述三七藥材粉末過(guò)10目篩;所述生長(zhǎng)因子為:碳酸鈣， 加入的所述碳酸鈣的重量為所述三七藥材粉末重量的〇. 01倍量，加水量為所述三七藥材粉 末重量的1.5倍;所述混均后的三七藥材粉末中含水量為60%。
[0028]進(jìn)一步的，所述步驟B中：滅菌條件為：于立式壓力蒸汽滅菌器中滅菌處理1小時(shí)； 避光培養(yǎng)條件為:29~31°C，65%RH。
[0029]進(jìn)一步的，所述步驟B中，所述靈芝種子液與所述三七藥材的重量比為2:1。
[0030] 一種抗腫瘤藥物，包含上述的三萜皂苷類化合物。
[0031]本發(fā)明的有益效果為：
[0032] (1)提供了一種新的三萜皂苷類化合物，用于新藥開(kāi)發(fā)，從而更好地發(fā)揮三七藥材 資源優(yōu)勢(shì)，對(duì)開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥十分重要的研究意義和社會(huì)效益。
[0033] (2)運(yùn)用體外抗腫瘤活性篩選體系對(duì)此新的三萜皂苷類化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，結(jié) 果表明，所述的化合物具有較好的抗腫瘤作用。經(jīng)過(guò)體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，表明具有明顯的 抗腫瘤活性，為制備抗腫瘤藥物提供了新的來(lái)源。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1是三萜皂苷類化合物的1H-NMR譜圖（CD30D，500MHz);
[0035] 圖2是三萜皂苷類化合物的13C-NMR譜圖（CD30D，125MHz);
[0036] 圖3是三萜皂苷類化合物的HMQC譜圖（CD30D，500MHz);
[0037] 圖4是三萜皂苷類化合物的HMBC譜圖（CD30D，500MHz);
[0038] 圖5是三萜皂苷類化合物的GC色譜圖（D-Glu);
[0039] 圖6是三萜皂苷類化合物的GC色譜圖（Sample)。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下文將結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本
【發(fā)明內(nèi)容】
。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述 的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更 好的技術(shù)效果。
[0041 ] 實(shí)施例1:
[0042] 一、本發(fā)明涉及的一種三萜皂苷類化合物結(jié)構(gòu)如下：
[0043]
[0044] 其化學(xué)名稱為:6-0-β-?-吡喃葡萄糖基-達(dá)瑪-17β(Η)-20(22)(Ε)_烯_3β，6α，12β， 24S，25-五醇。本發(fā)明所述三萜皂苷類化合物是從三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中首次分離得到的新化合 物，命名為人參皂苷ST-8。
[0045]本發(fā)明所述三萜皂苷類化合物物理化學(xué)常數(shù)如下：
[0046]白色粉末（甲醇），ESI-MS:m/z 677.42([M+Na] + )，m/z 689.40([M+C1] -)，結(jié)合氫譜 與碳譜推測(cè)其分子式為(^(6^620:(^10 %硫酸乙醇溶液顯紫紅色，Mol ish反應(yīng)陽(yáng)性， Liebermann-Burchard 反應(yīng)陽(yáng)性。1Η 和13C_NMR 數(shù)據(jù)見(jiàn)表 1。
[0047] 表1化合物的1H-NMR、13C_NMR數(shù)據(jù)歸屬信息
[0048]
[0049]
[0050] 經(jīng)體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，化合物能顯著抑制人宮頸癌細(xì)胞的擴(kuò)增，且呈現(xiàn)劑量依 賴關(guān)系，表明具有明顯的抗腫瘤活性。因此，可用于制備新的抗腫瘤藥物。
[0051 ]二、制備本發(fā)明三萜皂苷類化合物：
[0052]步驟一:三七轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備 [0053] A種子液的制備
[0054]按照微生物細(xì)菌生長(zhǎng)優(yōu)選的營(yíng)養(yǎng)型培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分：葡萄糖 2 %，蛋白胨0.5 %，酵母粉0.2 %，磷酸二氫鉀0.1 %，硫酸鎂0.1 %，pH自然的條件配制靈芝 種子液液體培養(yǎng)基。每l〇〇ml液體培養(yǎng)基分裝于250ml倒三角瓶中，包扎后置于壓力蒸汽滅 菌器中于121°C滅菌處理30分鐘。取出冷卻后，在無(wú)菌操作臺(tái)中接入保存好的斜面菌種。將 接有斜面菌種的液體培養(yǎng)基放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于27~29°C，160轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)至容器 中充滿大量澄清星芒狀菌球備用。
[0055] B轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備
[0056]取干燥的三七藥材，適度粉碎，過(guò)10目篩，得到三七藥材粉末，按照藥材生長(zhǎng)因子 S/S的比例加入碳酸鈣生長(zhǎng)因子，加入1