雞源sting基因熒光定量pcr檢測方法、引物對及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[00011本發(fā)明屬于雞源STING基因檢測技術(shù)領域，尤其涉及一種雞源STING基因熒光定量 PCR檢測方法、引物對及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] STING(Stimulator of interferon genes)蛋白是最近發(fā)現(xiàn)的一種重要的參與機 體固有免疫應答的受體分子，當各種病毒侵入機體被模式識別受體(PRRs)識別后，STING可 以激活NF-k B和IRF3介導的信號轉(zhuǎn)導途徑，誘導I型干擾素的產(chǎn)生，在機體抗病毒固有免疫 應答中發(fā)揮重要作用。因此，對雞氣管組織中STING進行精確的定量有助于進一步了解被檢 雞只的免疫狀態(tài)以及抗病毒免疫機制。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)是近年來常應用于定量檢測mRNA轉(zhuǎn)錄水平的一項新技術(shù)，該技 術(shù)具有快速、靈敏度高、特異性強等特點。然而，用SYBR Green I熒光定量PCR技術(shù)檢測雞 STING的檢測方法尚未見有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測快速、定量準確、特異性強、靈敏度高、 重復性和穩(wěn)定性好且無污染的雞源STING基因熒光定量PCR檢測方法、引物對及試劑盒。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:雞源STING基因熒光定量PCR檢 測引物對，堿基序列分別為：
[0006] 上游引物Si-F: 5' -TGACCGAGAGCTCCAAGAAG-3'，
[0007] 下游引物51-1?:5/-〇6丁66〇厶6厶厶0^(：1'1'11^6-3/。
[0008] 雞源STING基因熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有以下試劑：SYBR Premix ExTaqTM II、上游引*Si_F和下游引物&-R，上游引物和下游引物堿基序列分別為：
[0009] 上游引物Si-F: 5' -TGACCGAGAGCTCCAAGAAG-3'，
[0010] 下游引物51-1?:5/-〇6丁66〇厶6厶厶0^(：1'1'11^6-3/。
[0011] 上游引物和下游引物的濃度均為l〇ym〇l/L。
[0012] 上述雞源STING基因熒光定量PCR檢測試劑盒，還含有以下試劑：陽性質(zhì)粒和滅菌 ddH20〇
[0013] 上述雞源STING基因熒光定量PCR檢測試劑盒，含有以下試劑：SYBR Premix ExTaqTM II lO.OyL，上游引和下游引物S^R各0.5yL，陽性質(zhì)粒l.OyL和滅菌ddH2〇 8 yL，總共 20yL。
[0014] 雞源STING基因熒光定量PCR檢測方法，熒光定量PCR的反應體系和擴增程序分別 為：
[0015] 反應體系：SYBR Premix ExTaqTM II 10.0yL，上游引物Si-F和下游引物Si-R各0.5 yL，陽性質(zhì)粒1. OyL和滅菌ddH20 8yL，總共20yL;上游引物和下游引物堿基序列分別為：上 游引物Si-F: 5' -TGACCGAGAGCTCCAAGAAG-3'，下游引物Si-R: 5' -CGTGGCAGAACTACTTTCAG-3'; 上游引物和下游引物的濃度均為lOwnol/L;
[0016] 擴增程序:95°C預變性30s;95°C 5s，60°C 30s，擴增40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時檢 測熒光;熔解曲線分析95°C 0.5s，65°C 20s;最后50°C 30s結(jié)束。
[0017]發(fā)明人采用熒光定量PCR技術(shù)，根據(jù)雞源STING基因序列設計篩選出了一對特異性 實時熒光定量PCR引物，即上游引物SrF和下游引物&-R。據(jù)此，發(fā)明人還設計和建立了相應 的試劑盒和檢測方法。實驗表明，本發(fā)明具有檢測快速、定量準確、特異性強、靈敏度高、重 復性和穩(wěn)定性好且無污染的優(yōu)點。本發(fā)明為快速準確檢測雞源STING基因 mRNA相對表達水 平提供了技術(shù)平臺，也為進一步探究雞相關(guān)疾病的固有免疫機制提供了技術(shù)基礎。
【附圖說明】
[0018] 圖1是雞STING基因普通PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中：M:DL500 DNA Marker; 1:引物對一外周血白細胞PCR產(chǎn)物；2:引物對二外周血白細胞PCR產(chǎn)物;3:引物對三外周血 白細胞PCR產(chǎn)物;4:陰性對照;5:引物對一氣管組織PCR產(chǎn)物;6:引物對一脾臟組織PCR產(chǎn)物； 7:空白對照。
[0019 ]圖2是雞STING基因?qū)崟r熒光定量PCR標準品擴增曲線圖。
[0020] 圖3是雞STING基因?qū)崟r熒光定量PCR溶解曲線圖。
[0021 ]圖4是雞STING基因?qū)崟r熒光定量PCR標準曲線圖。
[0022] 圖5是雞感染IBV后雞氣管組織中STING基因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平圖。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1制備STING基因的標準曲線 [0024] 1.引物的設計及合成
[0025] 根據(jù)NCBI公布的雞的STING序列，應用primer 5.0和Oligo 7.0設計了三對特異性 引物，并交由北京六合華大公司合成。引物序列如下：
[0026] 引物對一:上游引物:Si-F: 5' -TGACCGAGAGCTCCAAGAAG-3'
[0027] 下游引物：Si-Rj' -CGTGGCAGAACTACTTTCAG-3'
[0028] 引物對二：
[0029] 上游引物：S2-F: 5' -TGACCGAGAGCTCCAAGAAG-3'
[0030] 下游引物：S2-R: 5' -AGCTCTTCCATGCACTCCTT-3'
[0031] 引物對三：
[0032] 上游引物：S3-F: 5' -GCTCCAAGAAGAATGTCGCTCA-3'
[0033] 下游引物：S3-R: 5' -AGCTCTTCCATGCACTCCT-3'
[0034] 2.雛雞外周血白細胞、脾臟和氣管等組織樣品的采集
[0035]經(jīng)翅下靜脈采集健康三黃雞新鮮抗凝血2mL，使用人外周血淋巴分離液進行外周 血淋巴白細胞，隨后撲殺健康三黃雞，無菌條件下采集脾臟和氣管組織，置于_80°C保存?zhèn)?用。3.雞外周血白細胞、脾臟和氣管等組織總RNA抽提
[0036]從-80°C冰箱取出保存的雞外周血白細胞、脾臟和氣管等組織樣品，外周血白細胞 樣品直接加入lmL裂解液混勻，用600yL裂解液注入氣管內(nèi)，反復沖洗20次，脾臟組織勻漿后 加入750yL裂解液混勻；將含組織樣品的裂解混合液于4°C，12000r/min離心10min，然后按 照動物組織總RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA。
[0037] 4.反轉(zhuǎn)錄雞氣管組織總RNA
[0038] 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將上述雞氣管組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0039] 5.雞氣管組織中STING基因 PCR擴增
[0040] STING基因 PCR擴增采用25yL體系，PCR Mix 12.5yL，上下游引物各lyL，RNase free water 8.5yL，cDNA模