基于霍亂毒素ct結(jié)構(gòu)遞藥載體蛋白及體外構(gòu)建方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于霍亂毒素 CT結(jié)構(gòu)遞藥載體蛋白及其 體外構(gòu)建方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 構(gòu)建一種載體來協(xié)助諸如大蛋白質(zhì)類藥物高效、低毒、無創(chuàng)傷地穿過血腦屏障來 治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病癥是目前研究的熱點。人體免疫缺陷病毒HIV反式激活因子TAT，是一 種富含大量陽離子的短肽，目前研究表明，TAT與目標蛋白基因融合后形成的融合蛋白，能 夠高效、快速、低劑量、無創(chuàng)傷地進入細胞，目前研究表明，但TAT的融合蛋白能在100ug/ml 的劑量下能于1小時內(nèi)進入細胞，并且在細胞內(nèi)的蛋白分布率達70 %以上。因此，TAT融合蛋 白顯著改善目標蛋白跨膜能力已經(jīng)毋庸置疑。天然的霍亂毒素(CT)分子由兩個部分組成(A 和B)，B作為載體的作用，天然的結(jié)構(gòu)為五聚體，其五聚體能與鼻腔內(nèi)的神經(jīng)節(jié)苷脂GMl結(jié)合 而并不進入細胞。A亞單位利用B亞單位五聚體中間的小孔，進入細胞，并于細胞體內(nèi)水解成 Al和A2部分，Al和細胞內(nèi)輔酶作用，干擾細胞信號，使細胞內(nèi)大量鹽離子外輸，進而導致機 體缺水，引起腹泄甚至死亡。研究表明，與B亞基作用形成天然霍亂毒素的為A2部分，A2與B 之間通過親疏水性的作用，緊密排列在一起，進而引導Al部分進入細胞，并致病。結(jié)合CT的 分子結(jié)構(gòu)，用EGFP替換Al部分，并加以TAT修飾，使EGFP通過B亞單位進入細胞后，能夠繼續(xù) 穿膜，直接穿過血腦屏障，最終，構(gòu)建獲得一種嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT.為了解決這 一難題。
[0003] 目前有專利報道通過將CTB和EGFP-CTA2-TAT共轉(zhuǎn)化到同一宿主菌里，通過雙抗性 篩選嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT。然而，事實是CTB具有五對二硫鍵，非常容易形成包涵 體，上清中無法通過WESTERN BLOT和ELISA的方法檢測出CTB的五聚體單位。并且在操作過 程中發(fā)現(xiàn)，CTB的包涵體的過表達，還會影響EGFP-CTA2-TAT蛋白上清的表達量，雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 化會造成宿舍菌內(nèi)部負荷過重，導致細菌難長、不表達外源蛋白甚至直接死亡。形成嵌合蛋 白CTB5/EGFP-CTA2-TAT，并使其保持熒光，穿膜活性，更是難上加難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是在于提供一種獲得一種新型的嵌合蛋白，并高度保持其生物活 性。該嵌合蛋白能與鼻腔處的神經(jīng)結(jié)苷脂受體結(jié)合，通過滴鼻給藥的方式，將蛋白EGFP-CTA2-TAT以無創(chuàng)的方式經(jīng)由鼻腔處進入體內(nèi)。在生物體內(nèi)，TAT與CTA2的KDEL序列協(xié)同作 作，大大提高EGFP穿膜的能力，使EGFP能夠順利穿過血腦屏障，并定位于腦部，以達到高效 治療腦部等神經(jīng)中樞性疾病。當載體上的EGFP(約26kd)替換為大小與之相類似的藥物蛋 白，即發(fā)揮了本載體遞藥的作用，該載體未來很有可能成為腦部疾病患者的良藥。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0006] 基于霍亂毒素 CT結(jié)構(gòu)遞藥載體蛋白，為CTB5/EGFP-CTA2-TAT，為CTB5以及EGFP-CTA2-TAT嵌合組裝而成。
[0007] 其中，CTB5的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0008] EGFP-CTA2-TAT的氨基酸序列為SEQIDN0:2所示。
[0009]基于霍亂毒素 CT結(jié)構(gòu)遞藥載體蛋白的體外構(gòu)建的方法，其步驟如下：
[0010] S1、基因克隆與表達
[0011] 采用BamHI/Hindin雙酶切的方法，將編碼CTB的基因克隆到雙基因表達載體 petduet-Ι的多克隆位點1的位置，構(gòu)建的載體命名為petduet-CTB;
[0012] 將編碼有EGFP-CTA-TAT的基因克隆到表達載體pet22b( + )中，并去除其信號肽，克 隆時選用的酶切位點為NdeI和Xhol，構(gòu)建的載體命名為pet22b-EGFP-CTA2-TAT;
[0013] S2、EGFP-CTA2-TAT可溶性蛋白表達與純化
[0014] 質(zhì)粒pet22b-EGFP-CTA2-TAT導入宿主菌，即大腸桿菌BL21 (DE3)中，并實現(xiàn)表達； pet22b-EGFP-CTA2-TAT在大腸桿菌BL21(DE3)系統(tǒng)中以可溶性形式表達，最終經(jīng)由Ni-NTA 純化得到電泳純的產(chǎn)品；
[0015] S3、霍亂毒素 B亞單位包涵體蛋白純化及復性
[0016] 質(zhì)粒petduet-CTB導入宿主菌BL21 (DE3)中，并實現(xiàn)表達，表達產(chǎn)物為包涵體，包涵 體通過洗滌，去除表面雜質(zhì)后，重新溶于梯度濃度的尿素中，通過電泳篩選純的CTB單體， CTB單體經(jīng)梯度透析復性形成穩(wěn)定的CTB5;
[0017] S4、體外組裝AB5結(jié)構(gòu)嵌合蛋白
[0018] 純化的CTB5與EGFP-CTA2-TAT通過超濾除去大部分的鹽離子后，按CTB5:EGFP- CTA2-TAT的質(zhì)量比為5:1至8: !的比例投入反應容器中，通過加入檸檬酸使混合物的pH值為 2.3-3.0之間，20s后迅速加入EDTA二鈉調(diào)節(jié)PH至8.5.室溫靜置至少1小時，直至熒光逐漸恢 復，即可。
[0019] 進一步地，設(shè)計引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和 CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用于從pet28a-CTB中擴增目標基因序列CTB即編碼CTB的基因。
[0020] 進一步地，設(shè)計引物如下：CGGAATTCCATATGG TGAGCAAGG 和 CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于從合成的基因序列中擴增具有酶切位點Ndel/Xhol的基因序 列EGFP-CTA2-TAT，即編碼有 EGFP-CTA-TAT 的基因。
[0021 ]進一步地，為方便純化，保留載體petduet-CTB上原有的組氨酸標簽。
[0022] 進一步地，為方便純化，保留載體pet22b-EGFP-CTA2_TAT上原有的組氨酸標簽。
[0023]進一步地，EGFP-CTA2-TAT的基因序列之間用連接肽作了相應的修飾。
[0024] 嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT用于腫瘤的治療。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是：
[0026] 1.體外組裝干擾少，實驗表明，得到的蛋白純凈度高，并且更穩(wěn)定。
[0027] 2.體外組裝區(qū)別于共轉(zhuǎn)化到同一宿主菌的是，重復性強，并且細菌表達無負擔，可 快速獲得蛋白原料。
[0028] 3.本發(fā)明首次驗證了嵌合蛋白CTB5/EGFP-CTA2-TAT與GMl的結(jié)合活性，并且結(jié)果 表明其保持與GMl結(jié)合的高度活性。
[0029] 4.本發(fā)明首次用HPLC的方法來驗證CTB5/EGFP-CTA2-TAT是否形成，結(jié)果表明， CTB5/EGFP-CTA2-TAT能夠經(jīng)由酸堿度調(diào)節(jié)形成。
[0030] 5.本發(fā)明區(qū)別于共轉(zhuǎn)化的是，單獨獲得了蛋白EGFP-CTA2-TAT與CTB5.并且，CTB5 有腫瘤殺傷力，EGFP-CTA2-TAT有相比于EGFP-TAT更高效的穿膜能力，在劑量為5ug下，可于 15min內(nèi)進入細胞，并且對細胞無殺傷力，相較于文獻報導的EGFP-TAT，100ug，l小時，有顯 著的劑量降低作用。
【附圖說明】
[0031] 圖 1 是質(zhì)粒 petduet-CTB 圖譜；
[0032] 圖 2 是質(zhì)粒 pet22b-EGFP-CTA2-TAT圖譜；
[0033] 圖3是蛋白電泳圖：
[0034]左起Marker(116kda，66· 2kda，45kda，35kda，25kda，18·4kda，14·4kda.); I ,CTB單 體純化結(jié)果;2，EGFP-CTA2-TAT蛋白純化結(jié)果;3，CTB復性后蛋白電泳結(jié)果；
[0035]圖4為用抗GFP-抗作用EGFP-CTA2-TAT蛋白結(jié)果及用抗CTB-抗作用CTB蛋白電泳 圖；
[0036]圖5是native page及藍光燈激發(fā)下AB5蛋白組裝結(jié)果示意圖：
[0037] A左起為marker(116kda，66·2kda，45kda，35kda，25kda，18·4kda，14·4kda); 1，組 裝的復合物蛋白電流結(jié)果2，CTB5組裝后結(jié)果3，EGFP-CTA2-TAT非變性電泳結(jié)果；
[0038] 圖6圖藍光燈激發(fā)下AB5蛋白組裝結(jié)果示意圖；
[0039] 圖 7是純化的 EGFP-CTA2-TAT的 HPLC圖譜；
[0040] 圖8是純化的CTB5的HPLC圖譜；
[0041 ]圖9是組裝后的混合物AB5的HPLC圖譜；
[0042]圖10是GMl-elisa測定蛋白與GMl的結(jié)合能力的示意圖；
[0043]圖11是熒光顯微鏡視野下的PC3細胞圖像：
[0044] A列為自然光下觀察的PC3細胞的結(jié)果，B列為熒光激發(fā)下觀察PC3細胞的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0045]以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限 定。
[0046]實施例中的部分原料試劑如下：
[0047] petDute-l、pet28a-CTB為本實驗室構(gòu)建;基因序列EGFP-CTA2-TAT由北京普爾普 樂公司合成;E.coli DH5a細胞、E. Co I i BL21 (DE3)細胞均由本實驗室保存，使用前進行菌種 測序鑒定；限制性內(nèi)切酶BamHI、HindΙΠ、Nde I、Xho I均購自Thermo公司；質(zhì)粒提取試劑盒、 PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素購自上海生物工程公司；瓊脂 糖、胰蛋白胨、氯化鈉、酵母粉購自瑞爾欣德公司；IPTG購自Sigma公司；丙煉酰胺、甲叉丙烯 酷胺、過硫酸銨、1^ 8、617(^116、505、考馬斯亮藍1?-250、1'?的11-20，異丙醇、冰醋酸、乙醇、甲 醇、甘油等均為國產(chǎn)分析純;pfu mix購自Novage公司；DL5000marker購自Novage公司?？贵w 購自SAB公司，CTB標準品購自sigma公司。電泳等其它試劑及耗材為國產(chǎn)分析純。
[0048] LB培養(yǎng)基的配置：
[0049] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉 IOg加入800ml的ddH20于燒杯中，充分溶解 后，用lmol/L NaOH調(diào)PH至7.0-7.2之間，最后定容于IL的容量瓶中。取5ml分裝于試管中， 121度，20min高壓蒸汽滅菌，備用。
[0050] 實施例1
[0051 ] 基因克隆與表達：
[0052] 參照圖 1和圖2,設(shè)計引物如下：CGCGGATCCAACACCTCAAAATATTACTGATTT和 CAGCCAACTCAGCTTCCTT，用于從pet28a-CTB中擴增目標基因序列CTB，設(shè)計引物如下， CGGAATTCCATATGG TGAGCAAGG和CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC，用于從合成的基因序列中擴增具 有酶切位點Ndel/Xhol的基因序列EGFP-CTA2-TAT.擴增后的CTB通過BamHI/Hindlll雙酶切 克隆入載體petduet-Ι的多克隆位點1的位置，而EGFP-CTA2-TAT通過Ndel/Xhol雙酶切克隆 入載體pet2