一種水稻黑條矮縮病抗性的分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種鑒定周期短、可靠性高的水稻黑 條矮縮病抗性的分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是被子植物門單子葉植物綱莎草目禾本科稻屬植物。水稻是最主要的三大 糧食作物之一，播種面積占糧食播種面積的1/5,年產(chǎn)量約4. 8億噸，占世界糧食總產(chǎn)量的 1/4,全世界二分之一以上的人口以水稻為主食，同時也是我國最主要的栽培作物之一。水 稻原產(chǎn)亞洲熱帶，是世界主要糧食作物之一。我國水稻播種面占全國糧食作物的1/4,而 產(chǎn)量則占一半以上，栽培歷史已有6000-7000年。水稻為重要糧食作物，除食用穎果外，可 制淀粉、釀酒、制醋，米糠可制糖、榨油、提取糠醛，供工業(yè)及醫(yī)藥用，稻桿為良好飼料及造紙 原料和編織材料，谷芽和稻根可供藥用，水稻在糧食產(chǎn)業(yè)安全、加工制造生產(chǎn)中具有重要地 位。
[0003] 水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒（Riceblack-streakeddwarf virus，RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飛虱為傳播介體進(jìn)行傳播。宿主有雜交水稻、常規(guī) 水稻、大麥、小麥、玉米、小米、高粱、看麥娘、早熟禾、罔草、稗草、馬塘等28種。近年來，隨著 耕作制度和栽培方式的變化、農(nóng)田生態(tài)多樣、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推廣，水稻 黑條矮縮病在江蘇、浙江、湖南等省大規(guī)模發(fā)生，迅速成為長江中下游稻區(qū)最主要的水稻病 害之一。據(jù)統(tǒng)計，2007年水稻黑條矮縮病僅在江蘇省局部地區(qū)發(fā)生，危害面積30. 8萬畝，至 2008年已迅速在淮北、沿海和里下河地區(qū)蔓延開，全省發(fā)病面積上升至400萬畝，其中僅病 株率80%以上的絕收田塊面積就達(dá)3萬畝，按平均畝產(chǎn)500公斤初步估算約損失稻谷1. 5 億公斤，造成了糧食減產(chǎn)、農(nóng)民減收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失，同時也嚴(yán)重挫傷了農(nóng) 民的種糧積極性，也對全國的糧食安全構(gòu)成極大的威脅。
[0004]目前，對水稻黑條矮縮病的防治主要是使用農(nóng)藥防治傳毒介體灰飛虱，但由于介 體昆蟲種群數(shù)量大，導(dǎo)致防治效果不佳，且存在環(huán)境污染。而培育抗病品種是防治各類病害 最為經(jīng)濟(jì)、有效的手段。篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗病種質(zhì)是開展抗病育種的前提和基礎(chǔ)，而抗性 基因定位和克隆，則為利用標(biāo)記輔助選擇等分子育種手段，加快和高效培育抗病品種提供 了全新和有利工具。但迄今水稻黑條矮縮病由于其危害嚴(yán)重，可防不可治，且當(dāng)前生產(chǎn)上推 廣的水稻品種大部分不抗病，因而急需培育和改良出水稻黑條矮縮病抗性品種，才能從根 本上減少該病帶來的損失。大規(guī)模篩選水稻種質(zhì)資源是培育抗性品種的基礎(chǔ)，對候選種質(zhì) 資源進(jìn)行抗性鑒定則是重要且必須的措施。
[0005]目前水稻育種上篩選抗病品種、抗病基因定位鑒定抗性家系均采用田間自然發(fā)病 鑒定，即將各鑒定品種或品系小區(qū)形式種植于大田，每個小區(qū)幾十株左右，大田常規(guī)栽培管 理，傳毒介體灰飛虱自然傳毒，待水稻顯現(xiàn)病癥后調(diào)查各鑒定品種(家系）小區(qū)的穴發(fā)病率， 以此為標(biāo)準(zhǔn)鑒別水稻品種(家系）的抗感能力的差異。然而，由于植物對天敵的抗性分為耐 害性、抗生性和排趨性三種類別，各種抗性類別具由不同的抗性機(jī)理，水稻也不其外。不同 水稻品種(家系）對灰飛虱排趨性的差異使得不同水稻品種(家系）的某些形態(tài)和生理等特 性，表現(xiàn)出對灰飛虱的取食偏向的差異。而水稻黑條矮縮病的傳毒介體正為灰飛虱，因此， 通過自然鑒定方法鑒定得到的抗病水稻，可能實際上是抗蟲(排趨性強(qiáng)）水稻而并非抗病水 稻。然而，假若以該抗蟲不抗病水稻育成品種進(jìn)行病害區(qū)規(guī)模種植后，規(guī)模種植導(dǎo)致傳毒介 體被迫選擇而使得水稻對灰飛虱排趨產(chǎn)生的假抗病表現(xiàn)消失，可能給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大的 損失。
[0006] 為排除排趨性對抗病鑒定的影響，定量水稻進(jìn)行人工定量接種帶毒介體成為一種 必然。目前，江蘇省農(nóng)科院周彤等利用人工篩選鑒定的除毒（RSV病毒）灰飛虱進(jìn)行人工飼 養(yǎng)，在室內(nèi)條件下以定量帶毒灰飛虱在水稻特定生育期接種待測水稻一定時間，培養(yǎng)待測 水稻至發(fā)病顯癥后，根據(jù)病害發(fā)生的嚴(yán)重度評價待測水稻對水稻黑條矮縮病的抗性水平， 該方法可以克服自然鑒定法中排趨性的干擾，實現(xiàn)了科學(xué)準(zhǔn)確的水稻抗病的評價。然而，進(jìn) 行水稻品種資源的抗性鑒定需要大量的傳毒介體灰飛虱，人工篩選無毒灰飛虱人工飼養(yǎng)規(guī) 模量小，難以滿足品種抗性鑒定的規(guī)模量的需求，限制了該方法的推廣應(yīng)用。
[0007] 科學(xué)技術(shù)發(fā)展日新月異，用于檢驗鑒定植物病毒的技術(shù)也迅速發(fā)展，除了傳統(tǒng)的 生物學(xué)方法、血清學(xué)方法、電子顯微鏡法、芯片檢測法，新興起的分子生物學(xué)方法給植物病 毒的鑒定提供了新方法。分子生物學(xué)方法主要是通過提取病毒的核酸（DNA、RNA)來檢測病 毒的種類和存在。目前主要應(yīng)用的定性檢測分子生物學(xué)方法包括病毒核酸分子雜交技術(shù)、 dsRNA電泳技術(shù)和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)，定量檢測主要是指實時熒光定量PCR技術(shù)。 此種方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測速度快，操作過程也比較簡便、可用于大量樣品檢測。熒 光定量PCR在植物病毒檢測與鑒定方面，能夠定量檢測病毒拷貝數(shù)。應(yīng)用熒光定量PCR檢 測未知樣本時，相比其他定量方法和普通PCR方法特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、靈敏度高、線性 關(guān)系廣、操作簡單安全，樣品的污染較底(樣品的擴(kuò)增和檢測在同一管內(nèi)進(jìn)行)，且不需要后 期處理。由于熒光定量PCR法對檢測未知樣品含量的優(yōu)越性，已經(jīng)在諸多領(lǐng)域如植物病理 機(jī)制研宄，轉(zhuǎn)基因研宄中的目標(biāo)基因表達(dá)水平和醫(yī)學(xué)臨床檢測方面得到了廣泛和成熟的應(yīng) 用。
[0008] 我們研宄證明對水稻植株接種RBSDV，不管是抗病還是感病水稻植株體內(nèi)，均檢測 到RBSDV病毒，另外水稻植株苗期感染RBSDV病毒之后，癥狀不凸顯，不能確定其抗病性，需 要等到分蘗盛期才能確定其抗病性。令人振奮的是，我們新近研宄發(fā)現(xiàn)水稻低氧萌發(fā)所產(chǎn) 生的胚芽鞘接種RBSDV病毒后一段時間胚芽鞘內(nèi)的RBSDV病毒增殖速度與水稻品種抗性直 接相關(guān)。胚芽鞘是水稻胚芽外的錐形套狀物，是一個鞘狀結(jié)構(gòu)，胚芽鞘本來是植物葉片的保 護(hù)組織，有保護(hù)胚芽中更幼小的葉和生長錐的作用。通常水稻植株感染RBSDV病毒都是在 水稻秧苗期通過灰飛虱傳毒的，而種子萌發(fā)產(chǎn)生胚芽鞘的傳毒研宄被忽略，我們研宄發(fā)現(xiàn) 胚芽鞘接種RBSDV病毒后一段時間胚芽鞘內(nèi)的RBSDV病毒增殖速度與水稻品種抗性直接相 關(guān)，我們的研宄發(fā)現(xiàn)給水稻黑條矮縮病抗病性的鑒定提供了新思路。
[0009] 本發(fā)明通過胚芽鞘培養(yǎng)前期激素的低氧誘導(dǎo)和胚芽鞘培養(yǎng)后期激素的抑制培養(yǎng) 來拓展胚芽鞘的生長時間，而在此時間內(nèi)通過熒光定量RT-PCR技術(shù)對接種病毒后胚芽鞘 內(nèi)的RBSDV含量進(jìn)行檢測，通過制作RBSDV增殖趨勢圖實現(xiàn)了接毒后胚芽鞘內(nèi)RBSDV病毒 增殖速度快速而準(zhǔn)確地測量，進(jìn)而快速鑒定水稻品種對黑條矮縮病的抗性水平和抗性等 級。這一鑒定方法除了可以應(yīng)用于水稻品種資源的發(fā)掘鑒定、品種抗性評價、抗病品種選育 外，亦可以應(yīng)用于抗病基因定位的表型鑒定和抗性遺傳規(guī)律研宄等眾多領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有水稻品種對水稻黑條矮縮病鑒定周期長、鑒定結(jié)果不準(zhǔn) 確等缺點，提供了一種鑒定周期短、可靠性高的水稻黑條矮縮病抗性的分子鑒定方法。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的： 一種水稻黑條矮縮病抗性的分子鑒定方法，其特征在于：該鑒定方法包括以下步驟： 1) 選擇鑒定標(biāo)尺：根據(jù)人工接毒鑒定中不同品種對水稻黑條矮縮病抗性表現(xiàn)設(shè)置高 抗、中抗、感病三個鑒定標(biāo)尺，選擇三個相應(yīng)水稻品種做為鑒定標(biāo)尺； 2) 低氧誘導(dǎo)待測水稻和鑒定標(biāo)尺品種的胚芽鞘：每個品種取15-20粒種子，用0. 6