鑒定水稻dna身份的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請屬于種子質(zhì)量檢測領(lǐng)域和分子育種領(lǐng)域。具體地，本申請涉及鑒定水稻DNA 身份的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長期以來，我國水稻種業(yè)中存在的主要問題有以下幾方面:一是育種材料復(fù)雜，遺 傳背景不清晰，重要農(nóng)藝性狀和優(yōu)異性狀缺乏有效的功能標(biāo)記或連鎖標(biāo)記，審定推廣的品 種同質(zhì)化嚴(yán)重，育種需要商業(yè)化集成技術(shù)提高效率;二是我國水稻種子市場在不同程度上 存在"多、亂、雜"現(xiàn)象，種子質(zhì)量檢測和市場監(jiān)測缺乏現(xiàn)代科技支撐;三是每個育種團隊的 育種材料相對封閉，缺少育種中間材料評價和交易平臺，使得很多育種材料局限在個別團 隊內(nèi)循環(huán)使用，不能充分廣泛交流、發(fā)揮育種材料的潛在價值。
[0003] 為了建立現(xiàn)代種業(yè)公平競爭的市場環(huán)境，加強種子管理和監(jiān)督管理，保護(hù)育種者 的知識產(chǎn)權(quán)、維護(hù)種業(yè)企業(yè)的正當(dāng)權(quán)益和保障農(nóng)民的合法權(quán)益，需要建立一套完善可靠、快 速準(zhǔn)確的水稻品種身份鑒定體系。
[0004] 我國新品種保護(hù)主要依賴于DUS(特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和 穩(wěn)定性(Stability))測試來鑒定植物品種的身份。然而，DUS表型測定周期長，且隨著鑒定 地點和時間不同會有差異，不適合用于構(gòu)建品種身份數(shù)據(jù)庫。
[0005] DNA分子標(biāo)記是開展商業(yè)化育種的重要核心技術(shù)，是精確、快速、高效鑒定水稻、玉 米等農(nóng)作物品種真實性和純度的重要手段。
[0006] 目前采用的種子質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)是利用SSR標(biāo)記進(jìn)行品種基因指紋鑒定，例如中華 人民共和國農(nóng)業(yè)彳丁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433-2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》，其中利用 48個SSR標(biāo)記來鑒定水稻品種。SSR標(biāo)記的應(yīng)用，相對于過去完全依靠田間表現(xiàn)和種子形態(tài) 性狀的種子質(zhì)量檢測，無論在可靠性和還是在準(zhǔn)確性上都有顯著提高。然而，由于SSR標(biāo)記 數(shù)目少，不能全面反映育種材料的遺傳背景，對于高代姊妹系品種、品種內(nèi)的變異和套牌品 種不能很好地區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] -方面，本申請?zhí)峁┝髓b定水稻DNA身份的方法，其包括利用水稻標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù) 據(jù)對水稻進(jìn)行DNA身份鑒定;或者利用水稻標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)和特征基因指紋數(shù)據(jù)對水稻 進(jìn)行DNA身份鑒定。
[0008] 具體地，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法，其包括通過檢測分布于水稻全基 因組的一組遺傳多樣性分子標(biāo)記的基因型，獲得水稻的標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)，由此鑒定所述 水稻的DNA身份。
[0009] 在具體實施方案中，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法，在獲得水稻的標(biāo)準(zhǔn)基 因指紋數(shù)據(jù)后，利用基因組相似度來鑒定所述水稻的DNA身份。
[0010] 在另一實施方案中，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法包括以下步驟：（1)分 別檢測分布于水稻全基因組的一組遺傳多樣性分子標(biāo)記的基因型，獲得至少兩種水稻的標(biāo) 準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)；（2)將所述水稻的全基因組劃分為多個區(qū)段；（3)對所獲得的至少兩種水 稻的標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)按所劃分的區(qū)段進(jìn)行比對，分別確定各個區(qū)段內(nèi)的遺傳多樣性分子 標(biāo)記的基因型是否存在差異；以及(4)統(tǒng)計遺傳多樣性分子標(biāo)記的基因型存在差異的差異 基因組區(qū)段數(shù)目，按下式計算基因組相似度，從而鑒定所述水稻的DNA身份：
[0011] GI = (l-x/n) X100%
[0012] 其中GI為基因組相似度，X為差異基因組區(qū)段數(shù)目，η為全基因組總區(qū)段數(shù)目。
[0013]在一具體實施方案中，其中所檢測的遺傳多樣性分子標(biāo)記的數(shù)目為3000~6000 個，優(yōu)選4000~5000個。
[0014] 在另一具體實施方案中，以750kb~1.0Mb，優(yōu)選約1.0Mb的物理距離，將所述水稻 的全基因組劃分300~400個區(qū)段，優(yōu)選350~400個區(qū)段，更優(yōu)選360~380個區(qū)段，其中平均 每個區(qū)段包含的遺傳多樣性分子標(biāo)記的數(shù)目為至少5個，優(yōu)選5~20個，更優(yōu)選10~15個。 [0015]在一實施方案中，在上述方法的步驟（1)中，通過SNP芯片檢測所述遺傳多樣性分 子標(biāo)記的基因型。在另一實施方案中，通過水稻全基因組育種芯片Rice6K檢測所述遺傳多 樣性分子標(biāo)記的基因型。
[0016] 在一實施方案中，在上述方法的步驟(4)中，若基因組相似度>95%，則鑒定所述 水稻為無明顯差異;或者，若基因組相似度<95%，則鑒定所述水稻為有明顯差異。
[0017] 在又一實施方案中，若所述水稻鑒定為無明顯差異時，上述方法還包括通過檢測 一組或多組反映水稻品種特征特性的特征分子標(biāo)記，獲得水稻的特征基因指紋數(shù)據(jù)，由此 進(jìn)一步鑒定水稻的DNA身份。
[0018] 在任選實施方案中，上述方法中所使用的特征分子標(biāo)記包括基因功能分子標(biāo)記、 基因單倍型分子標(biāo)記、基因區(qū)段重組分子標(biāo)記、親本特異遺傳分子標(biāo)記或其他標(biāo)記中的一 種或多種。進(jìn)一步任選地，上述方法中所使用的特征分子標(biāo)記選自從所述標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù) 據(jù)中檢出的差異區(qū)段內(nèi)的遺傳多樣性分子標(biāo)記。在另一任選實施方案中，通過單位點或多 位點檢測平臺檢測所述特征分子標(biāo)記的基因型。進(jìn)一步任選地，所述單位點或多位點檢測 平臺為TaqMan/KASP SNP標(biāo)記或OpenArray芯片。
[0019] 另一方面，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法，具體包括以下步驟：（1)使用水 稻全基因組育種芯片Rice6K，分別檢測分布于水稻全基因組的3000~6000個，優(yōu)選4000~ 5000個遺傳多樣性分子標(biāo)記的基因型，獲得至少兩種水稻的標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)；（2)以 750kb~1.0Mb，優(yōu)選約1.0Mb的物理距離，將所述水稻的全基因組劃分為300~400個區(qū)段， 優(yōu)選350~400個區(qū)段，更優(yōu)選360~380個區(qū)段，其中平均每個區(qū)段包含的遺傳多樣性分子 標(biāo)記的數(shù)目為至少5個，優(yōu)選5~20個，更優(yōu)選10~15個；（3)對所獲得的至少兩種水稻的標(biāo) 準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)按所劃分的區(qū)段進(jìn)行比對，其中若所劃分的區(qū)段內(nèi)有至少1個遺傳多樣性 分子標(biāo)記的基因型檢出存在差異，則確定該區(qū)段為差異基因組區(qū)段；以及(4)統(tǒng)計差異基因 組區(qū)段數(shù)目，按下式計算基因組相似度，從而鑒定所述水稻的DNA身份：
[0020] GI = (l-x/n) X100%
[0021] 其中GI為基因組相似度，X為差異基因組區(qū)段數(shù)目，η為全基因組總區(qū)段數(shù)目；其 中，若基因組相似度>95%，則所述水稻鑒定為無明顯差異;或者，若基因組相似度< 95%， 則所述水稻鑒定為有明顯差異。
[0022] 又一方面，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法，具體包括以下步驟：（1)使用水 稻全基因組育種芯片Rice6K，分別檢測分布于水稻全基因組的3000~6000個，優(yōu)選4000~ 5000個遺傳多樣性分子標(biāo)記的基因型，獲得至少兩種水稻的標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)；（2)以 750kb~1.0Mb，優(yōu)選約1.0Mb的物理距離，將所述水稻的全基因組劃分為300~400個區(qū)段，， 優(yōu)選350~400個區(qū)段，更優(yōu)選360~380個區(qū)段，其中平均每個區(qū)段包含的遺傳多樣性分子 標(biāo)記的數(shù)目為至少5個，優(yōu)選5~20個，更優(yōu)選10~15個；（3)對所獲得的至少兩種水稻的標(biāo) 準(zhǔn)基因指紋數(shù)據(jù)按所劃分的區(qū)段進(jìn)行比對，其中若所劃分的區(qū)段內(nèi)有至少1個遺傳多樣性 分子標(biāo)記的基因型檢出存在差異，則確定該區(qū)段為差異基因組區(qū)段；以及(4)統(tǒng)計差異基因 組區(qū)段數(shù)目，按下式計算基因組相似度，從而鑒定所述水稻的DNA身份：
[0023] GI = (l-x/n) X100%
[0024] 其中GI為基因組相似度，X為差異基因組區(qū)段數(shù)目，η為全基因組總區(qū)段數(shù)目；其 中，若基因組相似度>95%，則所述水稻鑒定為無明顯差異;或者，若基因組相似度< 95%， 則所述水稻鑒定為有明顯差異；（5)若所述水稻鑒定為無明顯差異時，通過檢測一組或多組 反映水稻品種特征特性的特征分子標(biāo)記的基因型，獲得水稻的特征基因指紋數(shù)據(jù)，由此進(jìn) 一步鑒定水稻的DNA身份。
[0025] 在任選實施方案中，上述方法中所使用的特征分子標(biāo)記包括基因功能分子標(biāo)記、 基因單倍型分子標(biāo)記、基因區(qū)段重組分子標(biāo)記、親本特異遺傳分子標(biāo)記或其他標(biāo)記中的一 種或多種。進(jìn)一步任選地，上述方法中所使用的特征分子標(biāo)記選自從所述標(biāo)準(zhǔn)基因指紋數(shù) 據(jù)中檢出的差異基因組區(qū)段內(nèi)的遺傳多樣性分子標(biāo)記。
[0026] 在另一任選實施方案中，通過單位點或多位點檢測平臺檢測所述特征分子標(biāo)記的 基因型。進(jìn)一步任選地，所述單位點或多位點檢測平臺為TaqMan/KASP SNP標(biāo)記或 OpenArray芯片。
[0027] 在本申請所提供的鑒定水稻DNA身份的方法中，對水稻的繁殖體進(jìn)行檢測。例如， 對至少20粒種子，優(yōu)選20粒種子的混合樣或單粒種子進(jìn)行檢測，或者對至少20株葉片，優(yōu)選 20株葉片的混合樣或單株葉片進(jìn)行檢測。
[0028]此外，本申請還提供了將上述所述鑒定水稻DNA身份的方法還可用于水稻新品種 認(rèn)定、水稻種子監(jiān)督管理或水稻品種維權(quán)等領(lǐng)域中，包括水稻新品種身份鑒定、水稻種質(zhì)資 源評價、水稻種子市場的監(jiān)管等。
[0029]因此，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法，其優(yōu)勢至少在于以下幾方面之一：
[0030] (1)-般情況下，如果差異標(biāo)記數(shù)一定，標(biāo)記分布越集中品種間的差異越小;某一 個區(qū)段如果有差異，只要標(biāo)記數(shù)目和代表性足夠，受所選用的特定標(biāo)記和檢測平臺的波動 性較小。本申請利用差異基因組區(qū)段比例代替現(xiàn)有的以差異標(biāo)記數(shù)目或比例來判斷品種身 份差異，這樣既可消除過度集中的差異基因型標(biāo)記引起的統(tǒng)計誤差，又解決了某區(qū)段標(biāo)記 選擇性和檢測平臺的使用問題。
[0031] (2)雖然水稻功能基因組研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展，大量重要農(nóng)藝性狀功能基因被 克隆，但是目前還無法解釋水稻全基因基因的功能以及相互關(guān)系，基因型和表型還無法做 到完全對應(yīng)。僅用一套標(biāo)準(zhǔn)基因指紋不能滿足需求。本申請進(jìn)一步提供的水稻標(biāo)準(zhǔn)基因指 紋和特征基因指紋的結(jié)合解決了這一難題。
[0032] 具體地，本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法中，用于品種身份鑒定的基因指紋 包含利用均勻分布于基因組的遺傳多樣性標(biāo)記檢測的品種標(biāo)準(zhǔn)基因指紋和利用品種特征 分子標(biāo)記檢測的品種特征基因指紋數(shù)據(jù)。這樣既解決了不同品種一般性鑒定，又解決了相 似品種的特異性鑒定。對于新品種保護(hù)和品種審定，既可以獲得品種的標(biāo)準(zhǔn)基因指紋，還可 以獲得該品種區(qū)別于近似品種的特征基因指紋。因此，在種子監(jiān)督管理和維權(quán)時，通常對該 品種的基本特征有一定了解，只需要通過特征基因指紋數(shù)據(jù)就可以對品種進(jìn)行鑒定。
[0033] (3)本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法具有檢測結(jié)果的可靠性和簡便可操作 性。品種標(biāo)準(zhǔn)基因指紋適合建立所有品種的基因指紋數(shù)據(jù)庫，可實現(xiàn)數(shù)字化和自動化。品種 特征基因指紋數(shù)據(jù)檢測成本較低，適合日常規(guī)?；臋z測。兩者的結(jié)合增加了檢測結(jié)果的 可靠性。
[0034] (4)本申請?zhí)峁┑蔫b定水稻DNA身份的方法，適用于新品種保護(hù)、品種審定、種子監(jiān) 督管理和品種維權(quán)等方向，貫穿種質(zhì)資源評價、育種材料確權(quán)和新品種身份鑒定等整個育、 繁、推過程。
【附圖說明】
[0035]圖1為利用195份微核心種質(zhì)資源芯片數(shù)據(jù)分析品種間DNA差異鑒定的最適標(biāo)記數(shù) 目。