SSR09的擴增結果見圖1，引物的序列信息見表1:
[0053]表1釉稻育成品種SSR特異多態(tài)性引物序列
[0化4]
[0055] (3)適宜樣本量：W引物SSR09的擴增結果為例，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，160單株中有140單株的 擴增結果完全一樣(主帶型），另外20單株DNA擴增結果與主帶型不同，將運些單株稱為特異 單株，如圖1中左起第2、4、6、7和11等泳道。160單株群體量中，特異單株頻率為12.5%。將 160株群體隨機分成10株、20株......150株不同大小群體，統(tǒng)計每個群體量特異性單株頻 率，統(tǒng)計20次計算平均值、標準偏差和變異系數(shù)。結果發(fā)現(xiàn)隨著群體量增加特異性單株頻率 逐漸增加（圖2)。群體量越小，特異性單株平均頻率越低，其標準偏差和變異系數(shù)很大，表明 采用過小的群體量，取樣誤差十分明顯。群體量增加至100單株時，特異單株頻率逐步穩(wěn)定 趨近12.5%，變異系數(shù)控制在15% W內(nèi)，基本可W代表160單株的多樣性。因此認為進行釉 稻育成品種遺傳完整性分析時，需要保證100株W上的群體量。
[0056] 實施例2不同生活力群體釉稻育成品種種質的遺傳完整性分析
[0化7] 1.實驗材料
[005引 W釉稻育成品種議晚釉19號為試材。采集釉稻育成品種種子，采用高溫高濕方法 老化種子獲得5個發(fā)芽率群體(具體見表2 )，每個群體取一定量種子育苗后移栽至大田進行 常規(guī)管理。每個群體隨機選取160個單株，取其幼嫩葉片，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0化9 ] 2.基因組DNA提取:采用CTAB法分別提取160個單株葉片的基因組DNA。
[0060] 3.不同生活力群體遺傳完整性比較:采用上述12對核屯、引物，對釉稻育成品種議 晚釉19號5個不同生活力群體的基因組DNA進行擴增，根據(jù)擴增結果分別計算各項遺傳參 數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)對照群體(發(fā)芽率>90%)的各個群體的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多 樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)各項指數(shù)均最高;發(fā)芽率80-85 %和60-70 %的群體的各項指標與對照 群體均無明顯差別;而發(fā)芽率50%及W下群體的所有指標均與高發(fā)芽率群體出現(xiàn)顯著差異 (表2)。分析結果表明，較高生活力的群體(發(fā)芽率60% W上）的遺傳完整性與對照群體一 致，而較
[0061] 低生活力群體(發(fā)芽率含50%)的遺傳完整性明顯改變。
[0062] 表2應用SSR標記對議晚釉19號5個不同發(fā)芽率水平的P0PGE肥分析
[0063]
[0064] *代表5%水平上顯著差異;林代表1%水平顯著差異。
[0065] 實施例3用于釉稻育成品種遺傳完整性分析的引物組合
[0066] SSR01 正向引物沈Q ID NO. Icaatttccataggctgcatg
[0067] 反向引物沈Q ID N0.2gcttgggttagcgacgac
[0068] SSR02正向引物沈Q ID N0.3gaagtgtgatcactgtaacc
[0069] 反向引物沈Q ID N0.4tacagtggacggcgaagtcg
[0070] SSR03正向引物沈Q ID N0.9tcgaagccatccaccaacgaag
[0071 ] 反向引物沈Q ID NO. lOtccgtacgccgacgaggtcgag
[0072] SSR04正向引物沈Q ID NO. llgtcccctccacccaattc
[0073] 反向引物沈Q ID NO. 12tcgtctactgttggctgcac
[0074] SSR05正向引物沈Q ID NO. 13accctctccgcctcgcctcctc
[0075] 反向引物沈Q ID NO. 14ctcctcctcctgcgaccgctcc
[0076] SSR06正向引物沈Q ID NO. 15ccgatctcatcaaccaactg
[0077] 反向引物沈Q ID NO. IScttcacgaggatctcaaagg
[0078] SSR07正向引物沈Q ID N0.21ctgtgtcgaaaggctgcac
[00巧] 反向引物沈Q ID N0.22cagtcctgtgttgcagcaag
[0080] SSR08正向引物沈Q ID N0.25tggctggctccgtgggtagctg
[0081 ] 反向引物沈Q ID N0.26tcccgttgccgttcatccctcc
[0082] SSR09正向引物沈Q ID N0.29cacatggcaccaacctcc
[0083] 反向引物沈Q ID N0.30gccaagtcattcactactctgg
[0084] SSRIO正向引物沈Q ID N0.31cgcagttgtggatttcagtg
[0085] 反向引物沈Q ID N0.32tgctcaacgtttgactgtcc
[0086] SSRll正向引物沈Q ID N0.33agaggagggttcagactatgg
[0087] 反向引物沈Q ID N0.34accttgaactcaggtgtctcc
[0088] SSR12正向引物沈Q ID N0.35agccccgaataaatccacct
[0089] 反向引物沈Q ID N0.36ctggaggagcatttggtagc〇
[0090] 實施例4用于釉稻育成品種遺傳完整性分析的試劑或試劑盒
[0091] 所述試劑和試劑盒含有實施例3所述的引物組合。
[0092] 所述試劑盒還可包括其他本領域其他常規(guī)組分。
[0093] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可^對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的運些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 用于秈稻育成品種遺傳完整性分析的引物組合，其特征在于，其由如下12個引物對 組成： SSR01:正向引物如SEQIDN0.1所示；反向引物如SEQIDN0.2所示； SSR02:正向引物如SEQIDN0.3所示；反向引物SEQIDN0.4所示； SSR03:正向引物如SEQIDN0.5所示；反向引物如SEQIDN0.6所示； SSR04:正向引物如SEQIDN0.7所示；反向引物如SEQIDN0.8所示； SSR05:正向引物如SEQIDN0.9所示；反向引物如SEQIDN0.10所示； SSR06:正向引物如SEQIDN0.11所示；反向引物如SEQIDN0.12所示 ； SSR07:正向引物如SEQIDN0.13所示；反向引物如SEQIDN0.14所示 ； SSR08:正向引物如SEQIDN0.15所示；反向引物如SEQIDN0.16所示 ； SSR09:正向引物如SEQIDN0.17所示；反向引物如SEQIDN0.18所示 ； SSR10:正向引物如SEQIDN0.19所示；反向引物如SEQIDN0.20所示 ； SSR11:正向引物如SEQIDN0.21所示；反向引物如SEQIDN0.22所示 ； SSR12:正向引物如SEQIDN0.23所示；反向引物如SEQIDN0.24所示。2. 含有權利要求1所述引物組合的試劑或試劑盒。3. 權利要求1所述的引物組合在分析秈稻育成品種遺傳完整性方面的應用。4. 一種分析秈稻育成品種遺傳完整性的方法，其特征在于，以待分析樣本的基因組DNA 為模板，利用權利要求1所述引物組合進行PCR擴增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物， 利用生物學軟件對電泳結果進行遺傳結構分析。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述待分析樣本的樣本量為100~160。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因組DNA提取自秈稻葉片，優(yōu)選幼嫩 葉片。7. 根據(jù)權利要求4或5所述的方法，其特征在于，采用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離擴增 產(chǎn)物，電泳結束后采用銀染法染色。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為：10 X PCR緩沖 液（含Mg2+)2.0yL，2.5mmol/L dNTP 1.5yL，5U/yL Taq 0.5yL，2ymol/L SSR引物2.0yL， 20ng/yL DNA 2.0yL,ddH2〇 12.0yL〇9. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序為:94°C預變性5min; 95°C 變性 30s，60°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，38 個循環(huán);72°C 延伸 lOmin。10. 根據(jù)權利要求4~6或權利要求8~9任一項所述的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 采用CTAB法提取秈稻育成品種待分析樣本葉片的基因組DNA，樣本為100~160單株 秈稻； (2) 以步驟(1)提取的DNA為模板，用權利要求1所述的引物組合進行PCR擴增； (3) 采用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離，電泳結束后采用銀染法染色； (4) 利用生物學軟件分析電泳結果。
【專利摘要】本發(fā)明涉及遺傳完整性分析引物，具體公開了用于秈稻育成品種遺傳完整性分析的SSR分子標記核心引物及其應用。本發(fā)明以秈稻育成品種贛晚秈19號為材料，通過大量實驗研究，篩選出了一批可用于秈稻育成品種遺傳完整性分析的SSR核心引物，建立了用于秈稻育成品種遺傳完整性分析的引物組合，并基于此，建立了分析方法。本發(fā)明提供的分析方法適用于秈稻育成品種種質遺傳完整性的分析。所篩選的引物組合和最少100個單株的群體量，為準確分析秈稻育成品種種質保存和繁殖更新過程中遺傳完整性檢測提供了標準方法。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105506141
【申請?zhí)枴緾N201610044390
【發(fā)明人】余麗琴, 辛霞, 黎毛毛, 尹廣鹍, 李慧, 張金梅, 吳錦文, 陳曉玲, 熊玉珍
【申請人】江西省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所, 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月22日