一種運用根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種運用根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉基因方法。不進行愈傷組織培養(yǎng)，將沾有外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌液的接種針直接侵染受體水稻種子的胚芽生長點，完成轉基因操作。分別選用含轉化質(zhì)粒pBI121-GUS的農(nóng)桿菌和pCDMARUBA-Hyg的農(nóng)桿菌為轉化載體菌株，以粳稻南粳45與南粳47和秈稻9311為轉基因受體水稻品種驗證了本發(fā)明。本方法與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導法不同的是，本方法不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，節(jié)省了大量的人力和財力，且時間比較短；克服了在其它方法中秈稻品種難以轉化的問題；轉化載體可不必插入標記基因，具有簡單、快速、高效、通用、安全的優(yōu)點，是一種改良的水稻轉基因新技術。
【專利說明】一種運用根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種運用根癌農(nóng)桿菌介導的簡單、快速、高效的水稻轉化方法的建立，屬于水稻遺傳改良與農(nóng)業(yè)生物技術應用領域。
【背景技術】
[0002]人口、資源、環(huán)境一直是人類生存與發(fā)展所面臨的主要問題。近年來，由于人口增長、氣候變化等因素，出現(xiàn)了全球性的糧食短缺，主要農(nóng)產(chǎn)品價格快速上漲，在世界范圍內(nèi)造成了糧食危機與恐慌。而水稻作為世界上最重要的糧食作物之一，進一步提高水稻產(chǎn)量具有極其重要的意義。但是，可利用的耕地和淡水資源逐年減少，大量使用農(nóng)藥、化肥導致環(huán)境嚴重污染同時增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本和農(nóng)民負擔，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)遭受嚴重破壞，因此，確保糧食安全的根本途徑在于提高作物單產(chǎn)。依靠慣有方法很難培育出在產(chǎn)量潛力上有大突破的新品種。近二十幾年來，通過轉基因技術培育轉基因高產(chǎn)作物不斷傳出佳訊。轉基因技術作為一種可持續(xù)發(fā)展的方式，可提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，具有良好的發(fā)展?jié)摿颓熬?，將為世界農(nóng)業(yè)發(fā)展注入新的動力[1]。
[0003]目前，在水稻育種上相繼開發(fā)研究的轉基因技術有以農(nóng)桿菌為主導的載體介導轉基因技術；以基因槍、PEG等介導的基因直接導入技術和以花粉管通道轉化、生殖細胞浸泡吸收為主的種質(zhì)系統(tǒng)轉化技術，尤以農(nóng)桿菌介導技術、基因槍導入技術和花粉管通道技術的研究報道最多，其中農(nóng)桿菌介導技術占64%[2]。
[0004]以載體介導的轉化，即利用另一種生物來實現(xiàn)基因的轉入和整合，主要的方法就是農(nóng)桿菌介導法。農(nóng)桿菌細胞內(nèi)的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒具有一段T-DNA，可通過農(nóng)桿菌侵染植物傷口進入細胞，并插入到植物基因組中。通過將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染，可實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術，再生出轉基因植株[3]。自`從1978年Chilton等M第一次利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒為載體將T-DNA上的胭脂堿基因轉入煙草細胞以來，根癌農(nóng)桿菌在雙子葉植物轉化中得到了廣泛應用。1986年，Baba等[5]通過PEG法將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體融合，獲得了能夠合成胭脂堿的水稻轉化組織。之后，科學界開始對農(nóng)桿菌介導的水稻轉化進行了廣泛的研究，試圖通過轉基因技術來提高水稻產(chǎn)量、改良品質(zhì)和增強抗性[6_8]。但是，由于國內(nèi)外各個實驗室所使用的基因型、外植體的不同和培養(yǎng)環(huán)境條件的差異，造成了各個轉化體系中的結果不盡相同，轉化率也普遍不高。所以，近二十幾年來，不同研究人員分別從Ti質(zhì)粒的改造、轉化載體的構建和組織培養(yǎng)方面入手，不斷優(yōu)化農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法，以期提高轉化效率。一是選擇最適農(nóng)桿菌及優(yōu)化載體。由于不同基因型水稻接受農(nóng)桿菌菌株的親和性不同，所以選取合適的農(nóng)桿菌菌株和優(yōu)良的質(zhì)粒對轉化來說非常重要。用于水稻轉化的農(nóng)桿菌菌株較為普遍的有A281、A656、LBA4404、EHAlOl、EHA105、AGLl。李雙成等[9]以3個秈稻品種和2個粳稻品種為對象，對農(nóng)桿菌轉化水稻過程中影響轉化效率的因素進行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株AGLl和EHA105按一定比例混合共轉化，對抗性愈傷率有顯著影響?，F(xiàn)在水稻農(nóng)桿菌介導應用最多的是EHA105菌株。[0005]對天然Ti質(zhì)粒的改造，最初只有共整合載體到現(xiàn)在的共整合載體、雙T-DNA載體、雙元載體、超級雙元載體都可利用；在轉化頻率不斷提高的同時，在去選擇標記上也不斷取得進步。1996年，Komari等[1°]構建了所謂的“超級雙元載體”，以該載體轉化農(nóng)桿菌LBA4404菌株，陽性菌液侵染水稻愈傷組織，共轉化率可達47%，轉化植株自交后代中，約65%的植株只含報告基因而不含標記基因。2004年，殷麗青等[11]運用農(nóng)桿菌介導的雙T-DNA法培育含反義蠟質(zhì)基因的無選擇標記水稻，獲得了 55.4%的共轉化率，轉化植株自交后代有29.2%的植株中只含有目的基因而不含選擇標記基因。夏志輝[12]利用DRB雙元載體培育無選擇標記的轉基因水稻。2005年，朱禎、李旭剛發(fā)明了一種利用雙T 一 DNA載體培育無選擇標記轉基因水稻的方法，單子葉植物表達載體中含兩個獨立T - DNA結構域且?guī)AR(matrix attachment region)序列,提高了獲得穩(wěn)定的無選擇標記的轉基因水稻的比率，并將該體系申請了專利[13]。2007年，朱麗等M嘗試利用共轉化和花藥培養(yǎng)技術相結合，快速獲得了純合的無選擇標記的三價轉基因水稻。這種方法僅需要一代即可獲得純合的目的植株，大大加快了研究進程。[0006]二是優(yōu)化組織培養(yǎng)因素。1996年，Rashid等[15]利用Hiei等[16]的轉化體系得到了較多的轉基因水稻植株。Aldemita等[17]報道，利用農(nóng)桿菌介導轉化秈稻品種IR72和TCS10，穩(wěn)定轉化率為1%-5%。1999年，Khanna等[18]利用農(nóng)桿菌介導轉化水稻，來源于根尖、芽尖、幼苗以及成熟胚盾片的愈傷組織都表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定轉化頻率。2001年，陳秀花等[19]以GUS基因的瞬時表達為依據(jù)，研究了農(nóng)桿菌介導轉化水稻的影響因素，指出預培養(yǎng)4-5天的幼胚是較為理想的轉化受體材料；在共培養(yǎng)基中添加較高濃度的乙酰丁香酮可提高GUS基因的瞬間表達頻率，按此條件進行雙菌共轉化，抗性愈傷組織的轉化率最高可達70%。2004年，夏志輝[12]利用DRB雙元載體培育無選擇標記的轉基因水稻，并對轉化效率的影響因素做了研究，(I)確定了轉化過程中的最佳侵染濃度為0D600=0.2 ； (2)MS培養(yǎng)基比CC培養(yǎng)基更適合水稻成熟胚愈傷組織的誘導，但CC培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更適合成熟胚愈傷組織的繼代培養(yǎng)；(3)水稻尤其是秈稻在分化過程中對潮霉素(Hyg)最為敏感，在分化培養(yǎng)基中添加20mg/L Hyg就足以將轉化細胞與非轉化細胞區(qū)分開。在壯苗生根培養(yǎng)階段，需要15mg/L的Hyg ； (4)出愈率與甘露醇的濃度密切相關，出愈率隨著甘露醇的減少而增加。2005年，PutuSupartana等[2°]利用農(nóng)桿菌介導直接侵染粳稻品種越光的胚芽生長點獲得轉基因植株，轉化效率高達40%。2010年，Kenjirou Ozawa等[21]發(fā)現(xiàn)，利用農(nóng)桿菌介導轉化，在共培養(yǎng)過程中，用N6液體培養(yǎng)基比用N6固體培養(yǎng)基轉化率提高了 10倍。2011年，李笑寒等_通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，建立了一個高效的水稻轉化技術體系。他們的研究結果表明，相比較于暗培養(yǎng)，光照培養(yǎng)進行愈傷誘導可以使誘導天數(shù)縮短4-5d;誘導培養(yǎng)基中加入適量的激素可以使秈稻愈傷誘導提高25%-30% ;分化培養(yǎng)基中加入適量的氨基酸和甘露醇可以使植株再生頻率提高15%_20%。AlagarsamyKarthikeyan等[23]利用農(nóng)桿菌侵染秈稻ADT43葉片來源的愈傷獲得轉基因植株，將秈稻的轉化率提高到9.33%，且在Ttl與T1代植株中，目的基因拷貝數(shù)為I或2。2012年，牟晨等[24]通過對經(jīng)典水稻轉基因方法的優(yōu)化和改進，使用成熟胚，采取升汞滅菌，侵染時農(nóng)桿菌的0D_值為0.1時，轉化效率較原方法提聞約23%。
[0007]綜上所述，農(nóng)桿菌介導轉基因技術經(jīng)過近二十幾年的發(fā)展和優(yōu)化，轉化條件、轉化效率等都得到了長足的改進和提高，但與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)形勢對轉基因產(chǎn)品的需求相比，其步伐仍然不夠快，仍存在許多障礙和安全隱患，仍需進一步加強農(nóng)桿菌介導轉化技術的研發(fā)，突破核心技術，以培育滿足人們需求的轉基因水稻新品種。
[0008]利用植物生長點轉化的原理可能是外源DNA通過細胞間隙進入莖尖生長點細胞部位，并轉化生長點細胞，產(chǎn)生轉基因后代。近年來，有一些關于植物生長點用于轉化的報道，特別是在小麥、玉米上。1996年，杜立群等[25]用小麥的生長點作為外源基因的直接受體，利用基因槍轟擊小麥生長點獲得轉基因小麥。2005年，RAZZAQ Abdul等[26]以小麥為材料，嘗試了一種對生長點直接進行轉化的方法，并初步證明了這一方法的可行性。2009年，董福雙等[27]以小麥品種石4185為對象，建立了“用解剖刀去除種子根、用鑷子把芽鞘掰去、用鑷尖掃去包蓋生長點的未展開葉、將帶生長點的部分與胚乳分離”為特點的受體制備方法，初步建立了基因槍法轉化小麥種子芽生長點的技術，但到目前為止還未見利用該技術在水稻轉基因操作相關的報道。2011年，孫傳波等[28]以玉米自交系鄭58的莖尖為受體，通過農(nóng)桿菌介導法將抗草甘膦EPSPS基因轉入玉米中，初步證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，以玉米莖尖作為受體的轉化系統(tǒng)用于基因轉化是可行、高效的。在水稻上，2001年，林擁軍利用農(nóng)桿菌浸種法將反義Wx基因?qū)胨酒贩N珍汕978[29]。2005年，PutuSupartana等[2°]利用農(nóng)桿菌介導直接侵染粳稻品種越光胚芽生長點獲得轉基因植株。但是，該文獻沒有提及在秈稻品種上成功轉化，不但所用的質(zhì)粒載體偏小，而且只包含了 I個外源基因。本技術方案不但在秈稻上獲得成功轉化，而且還成功將2個抗蟲基因同時轉入水稻中。
[0009]本技術建立了一套利用根癌農(nóng)桿菌介導，直接以水稻胚芽生長點為轉化受體而不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，避免對組織培養(yǎng)的過分依賴的高效、簡單、快速的水稻轉化體系；克服了在其它方法中基因型為秈稻品種難以轉化的問題；可以不需在質(zhì)粒載體上插入選擇標記基因，直接對轉化植株進行目的基因的檢測，減輕人們對轉基因生物安全性的擔憂，為轉化水稻提供一種簡單、快速、高效、安全的方法，從而為滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)形勢對轉基因產(chǎn)品的需求增添一份力量。
[0010]主要參考文獻:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0040]本發(fā)明針對傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導法過度依賴一系列的組織培養(yǎng)過程，而組織培養(yǎng)篩選周期較長，耗時耗費，對受體愈傷狀態(tài)要求高，基因型依賴強的技術難題，以水稻胚芽生長點為轉化受體，建立了優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導水稻轉化法，規(guī)避了傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導法對組織培養(yǎng)的過度依賴性，是本發(fā)明的宗旨。
[0041]本發(fā)明所采用的技術方案是:一種運用根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法，不進行愈傷組織培養(yǎng)，而是將沾有外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌液的接種針直接侵染受體水稻種子的胚芽生長點，完成轉基因操作。
[0042]本發(fā)明方法中所述受體水稻種子的胚芽生長點是切除種根和幼芽后的胚芽生長點，或者是未去殼萌發(fā)后的胚芽生長點。
[0043]本發(fā)明的方法既適用于粳稻品種也適用于秈稻品種。
[0044]本發(fā)明方法所述受體水稻種子可選自用成熟水稻種子浸泡24-36h后的材料。
[0045]本發(fā)明的一個實例，其主要步驟包括:
[0046]I)選用南粳45(粳稻)和9311 (秈稻)的成熟胚作為轉基因受體。
[0047]2)選用的轉化質(zhì)粒載體pBI121-GUS含gus基因；質(zhì)粒載體pCDMARUBA_Hyg含sbk、sck和hpt基因。
[0048]3)將未去殼的水稻種子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞殺菌18min，無菌水沖洗3-4次，消毒后的種子浸放在無菌水中，置于26-28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I-3d。
[0049]4)用沾有擴大培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌液的接種針直接侵染已經(jīng)處理過水稻種子的胚芽生長點(或者已切除種根和幼芽的胚芽生長點)，然后將侵染后的水稻種子放入植物培養(yǎng)瓶中(植物培養(yǎng)瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上鋪有一張濕潤的濾紙)；22-24°C暗培養(yǎng)9-14d。
[0050]5)將暗培養(yǎng)后苗長為IOcm左右的轉化苗浸泡在濃度為lmg/mL的頭孢霉素溶液中l(wèi)h，之后將苗移到網(wǎng)室中種在盆缽中，盆缽直徑30cm，5棵/盆[0051]6)在水稻長至7、8葉期，對轉pBI121-GUS載體的植株取葉片進行DNA檢測和⑶S組織化學檢測，對轉pCDMARUBA-Hyg載體的植株取葉片進行外源基因DNA檢測和抗蟲試紙條檢測。[0052]本發(fā)明的水稻轉化方法，具有以下優(yōu)點:
[0053]I)本發(fā)明方法不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，即不須配制各種培養(yǎng)基、控制各種培養(yǎng)條件并對其不斷進行優(yōu)化調(diào)整，利用傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導法獲得轉基因植株的周期至少為2-4個月，而應用本方法只需10-15d，由此可見，本發(fā)明技術在大大縮短培養(yǎng)周期的同時節(jié)省了大量的財力物力，極大的簡化了農(nóng)桿菌介導轉化法的流程，提高了轉化的工作效率。
[0054]2)本發(fā)明方法克服了在其它方法中基因型為秈稻品種難以轉化的問題，不僅將基因成功的導入粳稻品種南粳45中，而且也成功導入秈稻品種9311中。
[0055]3)本發(fā)明方法所用的轉化載體可以不須插入標記基因或報告基因，轉化載體只需攜帶目的基因和基本構件，在進行農(nóng)桿菌侵染轉化后待轉化植株成苗，直接對轉化植株進行目的基因的檢測，提高了轉基因水稻的安全性，減輕了人們對轉基因生物安全性的擔憂。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1質(zhì)粒PBI121-GUS結構示意圖。
[0057]圖2質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg結構不意圖。
[0058]圖3轉gus基因Ttl代植株的PCR檢測(M:DL2000DNA Marker ；ck:未轉化植株DNA ；
[0059]P:陽性質(zhì)粒DNA ；1-26:轉gus基因植株)。
[0060]圖4?；轉化植株的抗蟲基因sbk檢測(注:CK:未轉化植株；P:陽性質(zhì)粒DNA;M:DL2000Marker ；9:9311 ；45:南粳 45 ；83:南粳 47)
[0061]圖5部分轉基因Ttl代`植株gus基因的組織化學檢測(ck-:未轉化植株葉片)。
[0062]圖6部分轉基因T1代植株群體的PCR檢測(注:ck:未轉化植株DNA ；P:陽性質(zhì)粒DNA ；
[0063]M:DL2000Marker ;其余為轉基因T1代植株)。
[0064]圖7部分轉基因T1代植株gus基因的組織化學檢測(注:ck:未轉化植株)
[0065]圖STci轉化植株的PCR檢測(注:CK:未轉化植株;P:陽性質(zhì)粒DNA ；M:DL2000Marker ；41-49:南粳 45)。
【具體實施方式】
[0066]質(zhì)粒載體pBI121-GUS (Plant Cell R印orts, 2009，28 (9): 1319-1327)攜帶有PBI121-GUS質(zhì)粒的EHA105菌株，南京曉莊學院蔡小寧教授實驗室提供；
[0067]質(zhì)粒載體pCDMARUBA-Hyg (ZL02107429.1,朱禎李旭剛，一種利用雙T-DNA載體培育無選擇標記轉基因水稻的方法)引自中國科學院遺傳與發(fā)育研究所朱禎研究員項目組。
[0068]實施例1—胚芽生長點直接侵染法
[0069]1.選用水稻(Oryza sativa L.)品種南粳45 (粳稻)、南粳47 (粳稻)和9311 (秈稻)成熟種子作為轉基因受體，其種子均已商品化，來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所。
[0070]2.將未去殼的水稻種子先用75%的乙醇浸泡5min，再用0.1%的升汞殺菌18min，無菌水沖洗3-4次，消毒后的種子浸放在無菌水中，置于26-28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I-3d。[0071]3.植物表達載體農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與檢測
[0072]I)植物表達載體農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0073]A.分別取農(nóng)桿菌LBA4404菌液(帶有轉化質(zhì)粒pBI121_⑶S，質(zhì)粒pBI121_GUS結構如圖1)和農(nóng)桿菌EHA105菌液(帶有轉化質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg，質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg結構如圖2)200 μ L于1.5ml離心管中，用接種環(huán)進行平板劃線(培養(yǎng)皿中含卡那霉素，50ug/mL;利福平，50ug/mL)，28°C倒置培養(yǎng)48h，挑選單菌落接種于IOml的LB液體培養(yǎng)基中(含50mg
? L—1利福平和50mg.I/1卡那霉素)，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h。
[0074]B.取培養(yǎng)好的檢測有陽性質(zhì)粒的上述兩種菌液各1ml，分別放至IOOml液體LB培養(yǎng)基(含IOOuM乙酰丁香酮)中擴大培養(yǎng)，28°C 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD6c?值為0.4。為了便于觀察和使菌狀態(tài)良好，擴大培養(yǎng)液里不加抗生素。
[0075]2)植物表達載體農(nóng)桿菌陰陽性的檢測
[0076]A.質(zhì)粒DNA的提 取
[0077]用BIOMIGA EZgene公司生產(chǎn)的Plasmid Miniprep Kit試劑盒對上述兩種質(zhì)粒DNA進行微量提取，步驟如下:
[0078]①取I-4mL ( —般2mL)在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，室溫下10，OOOrpm離心lmin，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
[0079]②加入250 μ L已加入RNaseA的Bufffer Al，用渦流震蕩器震蕩重懸細菌沉淀，懸浮需充分，不應留有小菌塊。
[0080]③加入250 μ L Bufffer BI，溫和并充分地上下翻轉混合10次，然后靜置5min至
溶液粘稠而澄清。
[0081]④加入350 μ LBufffer NI，立即反轉多次，至溶液充分混勻，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
[0082]⑤將離心管轉至高速離心機,在室溫下13000rpm離心lOmin。
[0083]⑥小心吸取離心后的上清液至帶有收集管的DNA柱中，室溫下13000rpm離心Imin，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
[0084]⑦向DNA柱中加入500 μ L Buffer KB,室溫下13000rpm離心lmin,倒掉收集管中
的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
[0085]⑧向離心柱中加500 μ L DNA Wash Buffer (確保已加入無水乙醇！)，室溫下13，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復該步驟I次。
[0086]⑨將離心柱放回高速離心機中開蓋，室溫下13000rpm離心2min，以徹底去除殘留的乙醇。
[0087]⑩將離心柱移入新的1.5mL離心管中，向DNA柱正中央加入50-100 μ L的ddH20或Elution Buffer,室溫靜置2min, 13000rpm離心lmin,洗脫質(zhì)粒DNA。將洗脫液再加入柱中，13000rpm離心lmin,收集洗脫液。
[0088]B.質(zhì)粒DNA檢測
[0089]①質(zhì)粒pBI121-GUS基因擴增
[0090]目的基因gus。
[0091]PCR 擴增體系:PCR buffer2.0yL, dNTP2.0μ L，引物 2.0 μ L (表 1)，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，DNA2.0 μ L，補充 ddH20 M 20 μ L0
[0092]PCR 擴增程序為:94°C，5min ；94 °C, 30sec, 57 °C, 30sec, 72 °C，30sec，35 個循環(huán)；72°C，IOmin0擴增結果加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進行110v、lh電泳后照相。
[0093]選取PCR擴增結果為陽性的菌液進行擴大培養(yǎng)。
[0094]②質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg基因擴增
[0095]目的基因sbk、sck和標記基因hpt的PCR擴增體系和擴增程序均一致。
[0096]PCR 擴增體系:PCR buffer2.0 μ L，dNTP2.0 μ L，引物 2.0 μ L (表 1)，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，DNA2.0 μ L，補充 ddH20 M 20 μ L0
[0097]PCR 擴增程序為:94°C,5min ；94°C, 30sec, 56 °C, 30sec, 72 °C, 30sec, 35 個循環(huán)；72°C，lOmin。擴增結果加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳110v，Ih后照相。
[0098]選取PCR擴增結果為陽性的菌液進行擴大培養(yǎng)。
[0099]4.轉基因受體水稻品種的遺傳轉化
[0100]以下操作均要求在無菌條件下進行。
[0101]用沾有擴大培養(yǎng)后的0D_值為0.4擴大培養(yǎng)的農(nóng)桿菌液的接種針刺入胚芽生長點；將針刺后的種子放入植物培養(yǎng)瓶中(植物培養(yǎng)瓶里盛有2cm厚的蛭石，蛭石上鋪有一張濕潤的濾紙)，10粒/瓶，22-24°C暗培養(yǎng)9-14d。
[0102]用含質(zhì)粒pBI121-GU`S的農(nóng)桿菌按照上述方法侵染90粒南粳45水稻種子；用含質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg的農(nóng)桿菌按照上述方法侵染98粒9311、100粒南粳45和100粒南粳47水稻種子。
[0103]5.水稻轉化苗的殺菌與移苗
[0104]將暗培養(yǎng)后苗長為IOcm左右的轉化苗浸泡在lmg/ml的頭孢霉素溶液中Ih,之后將苗移到網(wǎng)室中種在盆缽中，盆缽半徑15cm，5棵/盆。
[0105]6.轉基因苗的PCR檢測
[0106]待處理后的苗長至7、8葉，株高40cm以上，每株取200mg左右嫩葉(以未針刺水稻苗為陰性對照)進行DNA檢測。
[0107]用SDS法從水稻(轉基因Ttl代與非轉基因)新鮮葉片中微量提取總DNA。
[0108](I)取約200mg新鮮的水稻葉片用液氮速凍后研磨成粉末，迅速轉移至2mL離心管中；
[0109](2)加入 650 μ L 經(jīng) 65°C預熱的 SDS 抽提緩沖液(0.1M Tris-HCl, ρΗ8.0 ；0.05ΜEDTA, ρΗ8.0 ；0.5Μ NaCl ；1.25%SDS)，65°C水浴 30min，每隔 IOmin 搖動混勻；
[0110](3)加入 150μ L5M KAc (ρΗ5.2)搖勻，冰浴 30min ；
[0111](4)加入350 μ L24:1的氯仿異戊醇混合液，搖動混勻，靜置3min ；
[0112](5) 12，OOOrpm離心lOmin，小心轉移上清于一潔凈的1.5mL離心管中；
[0113](6)加入800μ L-20°C預冷的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，在_20°C冰箱自由沉降20min ；
[0114](7) IOOOOrpm離心6min,棄上清收集沉淀；
[0115](8)加入400 μ L75%的乙醇洗滌沉淀；
[0116](9)倒掉乙醇，超凈臺上吹干沉淀后加入200μ LlXTE(pH8.0)溶解，_4°C保存?zhèn)溆?。[0117]非轉基因單株設為陰性對照，上述質(zhì)粒DNA檢測為陽性的質(zhì)粒DNA為陽性對照。以水稻基因組DNA為模板，轉質(zhì)粒pBI121-GUS的水稻植株以GUS基因的序列設計引物進行轉基因植株的PCR分析；轉質(zhì)粒pCDMARUBA-Hyg的水稻植株分別以SBK、SCK、HPT基因的序列設計引物進行轉基因植株的PCR分析(表I)。
[0118]表I基因位點或連鎖標記的引物序列
[0119]
【權利要求】
1.一種運用根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法，其特征在于該方法不進行愈傷組織培養(yǎng)，將沾有外源基因的根癌農(nóng)桿菌菌液的接種針直接侵染受體水稻種子的胚芽生長點，完成轉基因操作。
2.根據(jù)權利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法，其特征在于所述受體水稻種子的胚芽生長點是切除種根和幼芽后的胚芽生長點，或者是未去殼萌發(fā)后的胚芽生長點。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法，其特征在于所述的水稻是梗稻品種或軸稻品種。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉化方法，其特征在于所述受體水稻種子是用成 熟水稻種子浸泡24-36h后的材料。
【文檔編號】C12N15/84GK103451230SQ201310434861
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權日:2013年9月23日
【發(fā)明者】張啟軍, 顏文飛, 呂川根, 劉少奎, 賴東, 張斌, 秦海龍, 廖慧敏, 宗壽余, 夏士鍵, 虞德容 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院