一種非抗生素篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化紫花苜蓿葉綠體基因組的表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域中的重組載體構(gòu)建，特別設(shè)及一種重組的使用 非抗生素進(jìn)行篩選標(biāo)記的用于轉(zhuǎn)化紫花首猜葉綠體基因組的高效表達(dá)載體的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002] 1996年首例轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)投入市場(chǎng)進(jìn)行種植，隨著20多年的發(fā)展，全世界目 前已有25種轉(zhuǎn)基因作物批準(zhǔn)投入市場(chǎng)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，設(shè)及的作物主要有大豆、玉米、棉 花、油菜等，主要是在抗蟲(chóng)及抗除草劑方面。截止到2014年已有28個(gè)國(guó)家超過(guò)1.7億公頃的 轉(zhuǎn)基因作物種植雖然轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，但是公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因存在的安全問(wèn)題仍 存在很大的擔(dān)憂，反對(duì)轉(zhuǎn)基因呼聲從未停止過(guò)。
[0003] 從原理上來(lái)看，轉(zhuǎn)基因作物存在的風(fēng)險(xiǎn)主要是對(duì)環(huán)境安全和食品安全方面。環(huán)境 安全方面，考慮到花粉漂移可能會(huì)造成超級(jí)雜草使得常規(guī)的除草劑不再起作用，同時(shí)對(duì)生 物多樣性W及環(huán)境承受壓力等方面也會(huì)產(chǎn)生影響。食品安全性方面，轉(zhuǎn)入基因所表達(dá)的蛋 白是否會(huì)對(duì)人體或動(dòng)物產(chǎn)生影響，轉(zhuǎn)基因過(guò)程中使用的抗生素標(biāo)記基因?qū)θ嘶騽?dòng)物腸道微 生物帶來(lái)的影響等。如今如何建立安全的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系成為了目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的熱 點(diǎn)方向。
[0004] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)研究，提供一種重組的使用非抗生素進(jìn)行篩選標(biāo)記的用于轉(zhuǎn)化紫花首 猜葉綠體基因組的高效表達(dá)載體，該載體將用于W下方面：
[0005] 外源基因轉(zhuǎn)化紫花首猜葉綠體基因組研究并用W改良紫花首猜品質(zhì)；
[0006] 作為安全的轉(zhuǎn)基因技術(shù)載體，進(jìn)行安全的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種非抗生素篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化紫花首猜葉綠體基因組的植物表達(dá)載 體，所述載體包括紫花首猜葉綠體基因組中的化nA-TrnI基因片段，非抗生素篩選標(biāo)記基因 BADH基因，用于高效表達(dá)的調(diào)控序列煙草葉綠體基因組啟動(dòng)子Prrn和終止子化ski連接的 重組質(zhì)粒，其基因序列為序列表1的序列。
[000引本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體，其中的化nA-TrnI基因片段為序列表2的序列。
[0009 ]本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體，其中的BADH基因序列為序列表3的序列。
[0010] 本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體，其中的啟動(dòng)子Prrn序列為序列表4的序列。
[0011] 本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體，其中的終止子化洗a序列為列表5的序列
[0012] 本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體，通過(guò)對(duì)pUCM-T克隆載體的多克隆位點(diǎn)處插入化nA- Trnl基因片段后進(jìn)行改造得到的。
[0013] 本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體，其中，添加相關(guān)基因及序列后共改造1條載體，其添 加的基因和調(diào)控序列依次排列順序?yàn)椋?br>[0014] TrnA-Prrn-BADH-Tp sba-Prrn-Af e1-Τρ sba。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述的植物表達(dá)載體的制備方法，所述方法，步驟如下：
[0016] 步驟1，使用PCR擴(kuò)增紫花首猜TrnA-TrnI片段，并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T 載體上，
[0017] 步驟2,使用S引物PCR克隆方法將啟動(dòng)子序列與終止子序列連接到篩選標(biāo)記基因 BADH兩端，并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T載體上，
[001引步驟3,使用Ξ引物PCR克隆方法將啟動(dòng)子序列與終止子序列中間插入平末端酶切 位點(diǎn)Af el。并使用T/A克隆方法連接到pUCM-T載體上，
[0019] 步驟4，葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建
[0020] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體的制備方法，步驟如下：
[0021] 步驟1、基因擴(kuò)增，
[0022] TrnA-化nl序列：W紫花首猜葉綠體基因組為模板，使用引物化nA-F、TrnI-R進(jìn)行 克隆，連接到T載體上命名為pTrnA-TrnI;
[0023] 步驟2，Ξ引物PCR克隆方法將啟動(dòng)子序列與終止子序列連接到篩選標(biāo)記基因 BADH 兩端，連接到T載體上命名為pPaT，
[0024] 步驟3，Ξ引物PCR克隆方法將啟動(dòng)子序列與終止子序列之間插入Afel酶切位點(diǎn)， 連接到T載體上命名為pPAf elT，
[0025] 步驟4，構(gòu)建紫花首猜葉綠體表達(dá)載體pAf elA。
[0026] 更優(yōu)選的，本發(fā)明所述的植物表達(dá)載體的制備方法，步驟如下：
[0027] 步驟1，TrnA-TrnI片段的克?。?br>[002引 W首猜葉綠體基因組為模板，使用引物TrnA-F、Trn I-R進(jìn)行克隆;PCR擴(kuò)增條件:94 °C預(yù)變性5min，94°C變性60s，62°C退火30s，72°C延伸111111，35個(gè)循環(huán)后，72°(：延伸5111111，反應(yīng) 產(chǎn)物4 °C保存。
[0029] 使用1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，連接到T載體上命名為pTrnA-TrnI，
[0030] 步驟2,使用Ξ引物PCR克隆方法將啟動(dòng)子序列與終止子序列連接到篩選標(biāo)記基因 MDH兩端
[0031] 第一步，PCR擴(kuò)增基因融合片段：
[0032] W煙草葉綠體基因組為模板使用引物Prrn-F-時(shí)nI、Prrn-BADH-R擴(kuò)增啟動(dòng)子 Prrn。擴(kuò)增程序：94。(：，5111111;94。[，1.5111111;65。(：，453;72。(：，303;35個(gè)循環(huán)；72。[，10111111;4。[ 保存?；厥债a(chǎn)物分別記作:Prrn-BADH。
[0033] W人工合成的BADH為模板擴(kuò)增含有終止子化ste的小片段序列，使用引物BADH-F- Rong、BADH-Tpsba-R。擴(kuò)增程序：94Γ，5min; 94Γ，1.5min; 58Γ，30s; 72Γ，1.5min; 35個(gè)循 環(huán);72°C，10min;4°C保存。回收產(chǎn)物記作:BADH。
[0034] W煙草葉綠體基因組為模板使用引物Tpsba-F-RONG、Tpsba-R-BgI Π 擴(kuò)增終止子 Tpsba，擴(kuò)增程序：94°C，5min; 94°C，1.5min; 57 °C，30s; 72°C，30s; 35個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin; 4 °C保存?；厥债a(chǎn)物分別記作:Tpsba-BgI Π 。
[0035] 上述PCR反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增進(jìn)行凝膠電泳回收均按照本文第Ξ部分中所描述的 進(jìn)行。
[0036] 第二步:使用PCR對(duì)基因進(jìn)行融合：
[0037] 啟動(dòng)子Prrn、BADH基因、終止子Tpste的融合：
[003引取第一步中的回收產(chǎn)物Prrn-BADH和BADH，PCR反應(yīng)體系（總25化）：10 X ExBuf f er 2.扣1，(1饑'口（2.51111)241^'?1-84畑2化，84畑2化^開(kāi)日9酶（51]/41)0.341，(1地20 16.化1^。 反應(yīng)條件：94°C，5min; 94°C，45s; 64°C，45s; 72 °C，1.5min; 10個(gè)循環(huán)；72 °C，lOmin; 4°C保存。 反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)體系中加入引物Prrn-F-Kpn巧郵ADH-Tpsba-R各0.扣L，W反應(yīng)條件：94 °C，5min; 94°C，Imin; 60 °C，45s; 72°C，1.5min; 35個(gè)循環(huán)；72 °C，lOmin; 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后 使用0.1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，記作BADH-T。取回收產(chǎn)物BADH-T和Tpsba-Bgl Π， PCR反應(yīng)體系（總25化）：10 X ExBuff er 2.5μ1，dNTP(2.5mM)2μ1，BA畑-Τ 2化，Tpsba-Bgl Π 2 化，ExTaq酶（5υ/μ1)0.3μ1，(1 地20 16.化L。反應(yīng)條件：94°C，5min;94°C，45s;60°C，40s;72 °C，1.5min; 10個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin; 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)體系中加入引物Prrn-F- Κρη巧日Tpsba-R-Bgl Π 各0. W反應(yīng)條件：94°C，5min; 94°C，Imin; 58 °C，45s; 72°C，2min; 35個(gè)循環(huán);72°C，lOmin; 4°C保存。使用0.1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，通過(guò)T/A克隆連 接到pUCM-T載體上，命名為pPaT。
[0039] 步驟3，Ξ引物PCR克隆方法將啟動(dòng)子序列與終止子序列之間插入Afel酶切位點(diǎn)，
[0040] W煙草葉綠體基因組為模板分別擴(kuò)增含有Af el酶切位點(diǎn)和化洗a終止子5'部分基 因的啟動(dòng)子Prrn(引物：Prrn-F-Bgl Π 和Prrn-R-Af el)。擴(kuò)增程序：94°C，5min ; 94°C， 1.5min;65°C，45s;72°C，30s;35個(gè)循環(huán);72°C，10min;4°C保存?；厥债a(chǎn)物記作：Prrn-Afel。 WpTpsba為模板擴(kuò)增在終止子3 '含有Sal I (引物：Tpsba-F-RONG/Tpsba-R-Sal I)，擴(kuò)增程 序:94°C，5min; 94°C，1.5min; 57 °C，30s; 72 °C，30s; 35個(gè)循環(huán)；72°C，lOmin; 4°C保存?；厥债a(chǎn) 物分別記作：Tpsba-Sall。上述PCR反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增進(jìn)行凝膠電泳回收均按照本文第Ξ 部分中所描述的進(jìn)行。第二步:使用PCR對(duì)基因進(jìn)行融合：?jiǎn)?dòng)子Prrn-Af el與終止子化sba 的融合：取第一步中的回收產(chǎn)物Prrn-Afel和Tpsba-Sall，PCR反應(yīng)體系（總25化）：10X ExBuffer2.5μl，dNTP(2.5mM)化l，P;r;rn-Afel2liL，Tpsba-SalI2liL，ExTaq酶（5U/μl)0.3μ 1，d地20 16.化L。反應(yīng)條件：95°C，5min; 95°C，45s; 64°C，45s; 72°C，Imin; 10個(gè)循環(huán)；72°C， lOmin; 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)體系中加入引物Prrn-F-Bgl Π 和Tpsba-R-Sal I各0.扣 1，^反應(yīng)條件：94。(：，5111111;94。[，1111111;61。(：，453;72。[，1.5111111;35個(gè)循環(huán)；72。[，10111111;4。[ 保存。反應(yīng)結(jié)束后使用0.1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，通過(guò)T/A克隆連接到pUCM-T載體 上，命名為pPAfelT。