一種用于乳腺癌診斷的miRNA標(biāo)志物、其應(yīng)用及診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種用于乳腺癌診斷的miRNA標(biāo)志物、其應(yīng)用及診 斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌目前是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死 亡率增長(zhǎng)迅速。要降低乳腺癌病人的死亡率除了在病因預(yù)防上降低發(fā)病率外，提高早期診 斷水平和藥物治療的療效是兩個(gè)重要方面。然而，肺癌的早期診斷一直是一個(gè)世界性難題， 目前影像診斷(B超、鋼祀），化學(xué)診斷（癌反應(yīng)，血清學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo))及組織細(xì)胞學(xué)診斷是 腫瘤診斷的Ξ大支柱，前者在亞臨床期診斷上有很大局限性，后二者均W腫瘤標(biāo)志物作為 觀察指標(biāo)，可W比影像診斷更早發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在，具有高效、高靈敏性、方便、標(biāo)本易獲取及 創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，因此，在乳腺癌早期診治研究中，篩選及鑒定高特異性的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物 一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0003] 所謂腫瘤標(biāo)志物，是指在腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞生物合成、釋放或者 是腫瘤與宿主相互作用而產(chǎn)生的一類物質(zhì)，反映著腫瘤的存在和生長(zhǎng)。我們可通過(guò)利用化 學(xué)、免疫、分子生物學(xué)等技術(shù)對(duì)血液或分泌物進(jìn)行定性或者定量的檢測(cè)，通過(guò)對(duì)其分析，幫 助我們從正常組織中區(qū)別腫瘤或者測(cè)定腫瘤細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)W及對(duì)細(xì)胞膜上的特性進(jìn)行分 析，W此作為辨別腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志。乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展具有十分復(fù)雜的機(jī)制，其發(fā)病的最 初階段設(shè)及到許多乳腺癌相關(guān)基因及其表達(dá)的改變，在致癌因素的作用下患者體內(nèi)可表達(dá) 多種粘附分子及其受體或配體，在腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期其釋放標(biāo)志物含量也不一樣。
[0004] 由于乳腺癌組織病理的多樣性、同種病理腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和腫瘤生物學(xué)行為的 復(fù)雜性及多態(tài)性，造成單一標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值有限，只能反映了疾病某些側(cè) 面的變化，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者傾向于篩選多種有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，W提高乳 腺癌診斷的陽(yáng)性率。雖然聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于單項(xiàng)檢測(cè)已成共識(shí)，但并非任意一種組合均能提高 臨床診斷的陽(yáng)性率，在最佳組合上結(jié)論頗不一致，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)果。因此，尋找一種高 靈敏度、高特異性、可實(shí)際應(yīng)用于乳腺癌臨床診治的生物標(biāo)志物已成為乳腺癌研究中亟待 解決的問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種用于乳腺癌診斷的miRNA標(biāo)志物。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:一種用于乳腺癌診斷的miRNA 標(biāo)志物，所述標(biāo)記物包括 11111?-146日、11111?-155、11111?-21、11111?-222和11111?-339。
[0007] 在本發(fā)明的第二方面，提供了上述miRNA標(biāo)志物在制備乳腺癌診斷試劑盒中的應(yīng) 用。
[000引在本發(fā)明的第Ξ方面，提供了一種乳腺癌診斷試劑盒，其能夠測(cè)定組織中的1111尺- 146a、miR-155、miR-21、miR-222 和 miR-339 的含量。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒含有miR-146a，miR-155，miR-21，miR-222 和miR-339的引物和探針。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述引物和探針針對(duì)的目標(biāo)序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和沈Q ID NO.5所示。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒中含有美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的引物探針 組合，其產(chǎn)品編號(hào)分別為000468、002623、000397、002276和002184。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒中還含有內(nèi)參RNU44。
[001引所述診斷試劑盒還可W包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs，MgCl2和肥PC水等;還可W含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0014] 上述人類乳腺癌診斷試劑盒中優(yōu)選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑 是定量PCR擴(kuò)增試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑，運(yùn)些試劑的特性W及它們的配制方法均是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的；所述的試劑例如(但不限于）：陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品；還可W 包括巧光定量PCR反應(yīng)板、PCR反應(yīng)板封口膜等。
[0015] 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種技術(shù)(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分 析，溶液雜交檢測(cè)等)測(cè)定相關(guān)miRNA在乳腺癌患者和健康人群中的水平;在本發(fā)明的具體 實(shí)施方案中，使用了定量PCR的方法。
[0016] 在本發(fā)明的第四方面，提供了上述肺癌診斷試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
[0017] (1)從待測(cè)試樣品中提取總RNA;
[0018] (2)將步驟(1)提取得到的總RNA使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到相 應(yīng)的cDNA;
[0019] (3)將步驟(2)得到的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR，并WRNU44為內(nèi)參，檢測(cè)結(jié)果W Act表示，其中 Act = CtmiRNA-CtRNU44 ;
[0020] (4)將得到的結(jié)果代入公式ο. 987+0.032a-0.084b-0.061C+0.045d+0.004e中，將 計(jì)算值與0.709比較，如計(jì)算值大于0.709，則判斷為乳腺癌;如計(jì)算值小于0.709，則判斷為 非乳腺癌。其中a代表miR-146a的Act值，其中b代表miR-155的Act值，其中C代表miR-21的 Act值，其中d代表miR-222的Act值，其中e代表miR-339的Act值。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于:發(fā)明人通過(guò)廣泛的文獻(xiàn)調(diào)研，從公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)中篩選 出可能具有潛力的腫瘤標(biāo)志物，并通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)和分析，首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌具有較高 診斷價(jià)值的生物標(biāo)記物miR-146a、miR-155、miR-21、miR-222和miR-339五種miRNA;通過(guò) miRNA標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可W使得乳腺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī) 生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為提高臨床治療效果奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的 新型小分子藥物祀標(biāo)提供幫助。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為正常對(duì)照及乳腺癌組織中miRNA表達(dá)的R0C曲線圖。
[0023] 圖2為計(jì)算模型1所得預(yù)測(cè)概率的R0C曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 一、研究對(duì)象
[0025] 病例組為2009年2月至2012年12月在常州市第二人民醫(yī)院收集的96例乳腺癌病 例，均經(jīng)病理組織學(xué)確診，手術(shù)前未經(jīng)化放療。由于正常的醫(yī)療過(guò)程中無(wú)法取得健康女性的 乳腺標(biāo)本，因此對(duì)照組采用同期的纖維囊性乳腺病患者的手術(shù)標(biāo)本11例，取其中的正常組 織做為對(duì)照，按性別和年齡（±5歲）與病例進(jìn)行頻數(shù)匹配。用于研究的樣本為同期收取，采 樣、分裝、保存條件均一，通過(guò)對(duì)樣品資料的整理。
[0026] 二、研究方法
[0027] (1)使用10%中性甲醒充分固定手術(shù)標(biāo)本，脫水、石蠟包埋、切片、皿染色后，由病 理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行組織學(xué)診斷，確定腫瘤組織、正常組織區(qū)域，并進(jìn)行標(biāo)記。
[00%] (2)按照石蠟組織總RNA快速提取試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司）說(shuō)明書從石蠟組織中 提取總RNA。
[0029] (3)按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，貨號(hào)NO. 1302146R， 美國(guó)ABI公司）說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)總體積為15u 1 (總RNA加1，TaqMan MicroRNA Assay 3ul,核酸酶自由水4.16ul，RNase抑制劑0.19ul，緩沖液1.加1，]\11111:13(31'化日逆轉(zhuǎn)錄 酶 l.OOul 和 dNTP0.15ul)，在不同溫度下（16°(：，42°(：，85°(：，4°(：)進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)（3〇1111113， SOmins，5mins，lOmins)反應(yīng)。
[0030] (4)實(shí)時(shí)巧光定量PCR按照TaqMan試劑盒（TaqMan通用混合試劑盒11，貨號(hào) NO. 121207，美國(guó)ABI公司）說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系總體積為1 Oul，反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。PCR反 應(yīng)Ct值通過(guò)7900實(shí)時(shí)巧光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司）測(cè)定，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)Ξ次，WRNU44為內(nèi) 參。檢測(cè)結(jié)果W Act表示，其中Act = CtmiRNA-CtRNU44，Act值越大，表達(dá)量越低。
[00川 S、研究結(jié)果
[0032] 病例組 11111?-146日，11111?-155，11111?-21，11111?-222和11111?-339的水平顯著高于正常對(duì)照 組，具體數(shù)據(jù)如表1所示：
[0033] 表1:正常乳腺(NC)及乳腺癌(BC)組織中microRNA表達(dá)水平(Act，均值±標(biāo)準(zhǔn)差）
[0034]
[