一種利用乙酰乳酸脫羧酶催化脫羧測(cè)定乙酰乳酸合成酶活性的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種利用酶法催化脫簇來(lái)測(cè)定乙酷乳酸合成酶活性的新方法，是一種 生物酶學(xué)檢測(cè)技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酷乳酸合成酶(acetolactate synthase，EC 4.1.3.18)，又稱乙酷徑基酸合成 酶(acetohy化oxyacid synthase)，是植物和微生物中支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、鄉(xiāng)氨 酸等)生物合成過(guò)程中第一階段的關(guān)鍵酶。通過(guò)抑制乙酷乳酸合成酶活性可W破壞植物支 鏈氨基酸的生物合成，使得蛋白質(zhì)合成受阻，從而干擾細(xì)胞分裂，影響植物生長(zhǎng)，導(dǎo)致植物 死亡。由于動(dòng)物(包括人）的體內(nèi)不含乙酷乳酸合成酶，故此酶一直是除草劑研發(fā)中的重要 祀標(biāo)。乙酷乳酸合成酶抑制劑類除草劑因其高效、廣譜、高選擇性和環(huán)境相容性等優(yōu)點(diǎn)而備 受關(guān)注，但長(zhǎng)期、單一的施用也引發(fā)了雜草抗藥性，因此目前許多關(guān)于新的乙酷乳酸合成酶 抑制劑類除草劑的研究仍在進(jìn)行中。乙酷乳酸合成酶抑制劑也在油菜雜交劑中被應(yīng)用。最 近還有W真菌和細(xì)菌的乙酷乳酸合成酶作為祀標(biāo)開發(fā)新的殺菌劑和抗生素的研究報(bào)道。啤 酒生產(chǎn)中，酵母合成鄉(xiāng)氨酸和亮氨酸過(guò)程中的副產(chǎn)物雙乙酷是啤酒風(fēng)味物質(zhì)，該過(guò)程也依 賴于細(xì)菌的乙酷乳酸合成酶。因此，研究乙酷乳酸合成酶，準(zhǔn)確、方便地測(cè)定生物材料中乙 酷乳酸合成酶的活性具有重要價(jià)值。
[0003] 乙酷乳酸合成酶能催化2分子丙酬酸生成乙酷乳酸，或催化1分子丙酬酸和1分子 的2-酬下酸生成2-乙酷基-2-徑基下酸，再經(jīng)過(guò)多步生化反應(yīng)形成支鏈氨基酸。乙酷乳酸合 成酶需要在焦憐酸硫胺素(ThDP)、l個(gè)二價(jià)金屬離子和黃素腺嚷嶺二核巧酸(FAD)存在的情 況才能發(fā)揮催化活性。目前應(yīng)用范圍最廣的生物材料乙酷乳酸合成酶活性測(cè)定方法可稱為 "硫酸脫簇測(cè)定法"（例如化aleff and Mauvais,Science, 1984,224:1443-1445;Singh et al ,Anal}ftical Biochemishy, 1988,171:173-179)。該方法的設(shè)計(jì)原理為，乙酷乳酸合成 酶在含有化DP、FAD、Mgh的反應(yīng)液中，在37°C條件下催化反應(yīng)緩沖液中2分子丙酬酸生成乙 酷乳酸，反應(yīng)化后加入硫酸終止酶促反應(yīng)，60°C水浴15min，利用硫酸使乙酷乳酸脫簇轉(zhuǎn)變 為3-徑基下酬，在含脈基化合物的存在下與1-糞酪形成紅色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在520-530nm 處有特定的吸收峰。可W通過(guò)測(cè)定520-530nm處吸光度來(lái)計(jì)算乙酷乳酸合成酶的活性。
[0004] 除了上述"硫酸脫簇測(cè)定法"外，有專利（申請(qǐng)公布號(hào):CN 101900676A)還公布了一 種利用光譜技術(shù)檢測(cè)油菜葉片乙酷乳酸合成酶活性的方法，可稱為"特征光譜測(cè)定法"。烘 干殺青的油菜葉片粉末為非透明介質(zhì)，當(dāng)光波照射到其表面時(shí)，除部分被吸收外，其余均發(fā) 生反射，光波反射率跟油菜內(nèi)部化學(xué)物質(zhì)含量相關(guān)，乙酷乳酸合成酶的活力跟少數(shù)某些特 征波長(zhǎng)光波的反射率有關(guān)。"特征光譜測(cè)定法"是通過(guò)對(duì)少數(shù)特征波長(zhǎng)光波的反射率進(jìn)行回 歸分析，來(lái)檢測(cè)乙酷乳酸合成酶活力。該方法能反映乙酷乳酸合成酶的存在，但在準(zhǔn)確測(cè)定 該酶的活性方面仍存在一定局限性，且該方法不適用于其它類型生物材料如真菌、細(xì)菌乙 酷乳酸合成酶活性的檢測(cè)，因此未見到將其應(yīng)用于油菜之外材料的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種利用乙酷乳酸脫簇酶催化脫簇測(cè)定乙酷乳酸合成酶活性的方法 及其應(yīng)用，測(cè)定方法簡(jiǎn)稱"酶催化脫簇測(cè)定法"。該方法可W廣泛用于植物、真菌和細(xì)菌等多 種生物材料中乙酷乳酸合成酶活性的測(cè)定，并可用于乙酷乳酸合成酶抑制劑的篩選或鑒 定。
[0006] 一種利用乙酷乳酸脫簇酶催化脫簇測(cè)定乙酷乳酸合成酶活性的方法，包括如下步 驟：
[0007] (1)將乙酷乳酸合成酶粗酶液、乙酷乳酸脫簇酶、蒸饋水與含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖 液混勻后進(jìn)行酶促反應(yīng)，得酶促反應(yīng)液；
[000引（2)向酶促反應(yīng)液和空白對(duì)照液中加入顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色后離屯、取上清 液，用分光光度計(jì)檢測(cè)酶促反應(yīng)液在530nm波長(zhǎng)處的吸光度A530 ,按如下公式計(jì)算乙酷乳酸 合成酶粗酶液的酶活性：
[0009] 乙酷乳酸合成酶活性=AA53〇/([Pr] · t)
[0010] 式中Δ As3〇是W空白對(duì)照液調(diào)零后測(cè)得的As3〇值；[Pr]是乙酷乳酸合成酶粗酶液中 所含蛋白量，Wmg為單位;t是酶促反應(yīng)時(shí)間，Wh為單位;所得乙酷乳酸合成酶活性的單位 為 A A530 · mg Pr-i · h-i。
[0011] 本發(fā)明的原理是測(cè)定時(shí)同時(shí)加入乙酷乳酸合成酶粗酶液和乙酷乳酸脫簇酶，使乙 酷乳酸合成酶催化合成的乙酷乳酸立即被乙酷乳酸脫簇酶脫簇（即乙酷乳酸合成和脫簇反 應(yīng)同步進(jìn)行），轉(zhuǎn)變?yōu)?-徑基下酬，再加入肌酸和1-糞酪形成紅色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在520- 530nm波長(zhǎng)處有特定的吸收峰。
[001^ 優(yōu)選地，步驟（1)中酶促反應(yīng)條件為:36~38°C水浴條件下反應(yīng)0.8~1.2h。進(jìn)一步 優(yōu)選地，37 °C水浴條件下反應(yīng)化。
[0013] 優(yōu)選地，步驟(1)中：W乙酷乳酸合成酶粗酶液為ImL計(jì)，乙酷乳酸脫簇酶的添加量 為8~12μ1、含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液的添加量為0.8~1.2mL，蒸饋水的添加量為45~55μ 1〇
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選，W乙酷乳酸合成酶粗酶液為ImL計(jì)，乙酷乳酸脫簇酶的添加量為10μ 1、含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液的添加量為ImL，蒸饋水的添加量為50μ1。
[0015] 加入的乙酷乳酸脫簇酶，可W是純化的乙酷乳酸脫簇酶，也可W是非純化的乙酷 乳酸脫簇酶，優(yōu)選地，乙酷乳酸脫簇酶膽備液的酶活力大于2000U/mL(優(yōu)選在2500U/mL左 右。lU/mL指在30°C，pH 6.0條件下，lmL酶液每分鐘可催化乙酷乳酸脫簇生成Ιμπιο? 3-徑基 下酬），實(shí)驗(yàn)前用蒸饋水將其稀釋100倍，步驟（1)中所加乙酷乳酸脫簇酶為稀釋100倍后的 酶液。
[0016] 加入乙酷乳酸脫簇酶的方法包括單獨(dú)加入或溶于反應(yīng)緩沖液后加入。
[0017] 最優(yōu)選地，酶促反應(yīng)液按如下方法制備：向試管中加入ImL粗酶液，1化1稀釋100倍 的乙酷乳酸脫簇酶，ImL反應(yīng)緩沖液，加入50μ1蒸饋水，充分混勻后于37°C水浴條件下反應(yīng) Iho
[0018] 優(yōu)選地，含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液用pH 6.8~7.2的憐酸鐘緩沖液配制，其中含有 180~220mmol/L丙酬酸鋼、0.45~0.55mmol/L焦憐酸氯化硫胺素、0.025~0.035mmol/L FAD和 1.5~2.5mmol/L MgCb。
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選，含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液用50mmol/L憐酸鐘緩沖液(pH 7.0)配置， 其中含有200mmol/L丙酬酸鋼、0.5mmol/L焦憐酸氯化硫胺素、0.03mmol/L FAD和2.Ommol/L MgCbo
[0020] 空白對(duì)照液由如下方法得到：
[0021] 將乙酷乳酸合成酶粗酶液與同步驟（1)中蒸饋水相同體積的硫酸混勻，然后加入 乙酷乳酸脫簇酶混勻，再加入含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液混勻，進(jìn)行與步驟(1)相同的酶促反 應(yīng)，其中乙酷乳酸合成酶粗酶液、乙酷乳酸脫簇酶和含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液的加入量及 濃度與步驟(1)中相同。
[0022] 優(yōu)選地，W乙酷乳酸合成酶粗酶液為ImL計(jì)，乙酷乳酸脫簇酶的添加量為8~12μ1、 含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液的添加量為0.8~1.2mL，硫酸的添加量為45~55μ1。
[0023] 進(jìn)一步優(yōu)選，W乙酷乳酸合成酶粗酶液為ImL計(jì)，乙酷乳酸脫簇酶的添加量為10μ 1、含丙酬酸鋼的反應(yīng)緩沖液的添加量為ImL，硫酸的添加量為50μ1。
[0024] 硫酸為25~35 %的硫酸，優(yōu)選為30 %的硫酸，用蒸饋水稀釋濃硫酸配制。
[0025] 空白對(duì)照液最優(yōu)由如下方法得到：向試管中加入50μ1 30%硫酸，加入1ml粗酶液， 充分混勻，加入1〇μ1稀釋100倍的乙酷乳酸脫簇酶，充分混勻，加入1ml反應(yīng)緩沖液，再次充 分混勻后于37°C水浴條件下反應(yīng)化。
[0026] 所述顯色劑為0.5%(W/V)肌酸和9%(W/V)1-糞酪溶液。其中0.5%(W/V