)肌酸用蒸 饋水配制，9% (W/V) 1-糞酪溶液用4mol/L NaOH配制。
[0027] 優(yōu)選地，顯色反應在55~65°C水浴中進行10~20min，然后室溫下放置10~20min。 進一步優(yōu)選為60°C水浴中進行15min，然后室溫下放置15min。
[0028] 進一步優(yōu)選地，顯色反應為：W乙酷乳酸合成酶粗酶液為ImL計，向反應結(jié)束后的 各試管中加入0.5% (W/V)肌酸、9% (W/V) 1-糞酪溶液各500μ1，60°C水浴加熱15min，室溫下 放置15min。
[0029] 乙酷乳酸合成酶粗酶液中所含蛋白量的測定用經(jīng)典的考馬斯亮藍G250染色法測 定，用牛血清白蛋白繪制標準曲線，然后計算各管反應液中所加入粗酶液的蛋白量。
[0030] 乙酷乳酸合成酶粗酶液可來自植物、真菌、細菌等各種生物材料，也可W是通過生 物工程方法人工表達的產(chǎn)物，也可W是經(jīng)過純化操作的乙酷乳酸合成酶待檢溶液。
[0031] 優(yōu)選地，所述乙酷乳酸合成酶粗酶液來自于植物材料、真菌材料或細菌材料。
[0032] 本發(fā)明的方法能夠準確測定植物、真菌及細菌中乙酷乳酸合成酶的活性。
[0033] 來自于植物材料的乙酷乳酸合成酶粗酶液制備方法如下：
[0034] 取植物材料，依據(jù)不同植物組織稱取適量，加液氮研磨為粉末后按W/V(植物材料 鮮重g:緩沖液體積ml) = 1:3-5的比例加入酶提取緩沖液，充分混勻，冰浴浸提20-40min，浸 提液用兩層紗布過濾，將濾液在4°C，12000巧m離屯、20min，得到的上清液為粗酶液。
[0035] 來自于真菌材料的乙酷乳酸合成酶粗酶液制備方法如下：
[0036] W核盤菌為例，取菌絲盡量壓干水分后稱量10-15g，用液氮研磨成粉末，按W/V(菌 絲鮮重g:緩沖液體積ml) = 1:2-3比例加入酶提取緩沖液，充分混勻，冰浴浸提20-40min。浸 提液用兩層紗布過濾，將濾液在4°C，12000巧m離屯、20min，得到的上清液為粗酶液。
[0037] 來自于細菌材料的乙酷乳酸合成酶粗酶液制備方法如下：
[003引 W大腸桿菌DH 5α為例，取細菌培養(yǎng)液于4000rpm離屯、20min，取沉淀加入適量蒸饋 水重懸浮，再次于相同條件下離屯、，棄上清，用蒸饋水重復洗涂一次，離屯、后棄去上清液，將 沉淀倒扣于吸水紙上，稱重，通過減去離屯、管重量估算大腸桿菌菌體質(zhì)量。取大腸桿菌菌體 沉淀約0.5-lg，按W/V(菌體鮮重g:緩沖液體積ml) = 1:20-25的比例加入酶提取緩沖液，用 超聲波細胞破碎機破碎菌體(200-400w，2.5-5s工作時間/5-lOs間隔時間，20-40min)。將破 碎的大腸桿菌懸浮液于4°C ,12000巧m離屯、20min，得到的上清液為粗酶液。
[0039] 乙酷乳酸合成酶提取緩沖液(簡稱酶提取緩沖液）：用O.lmol/L憐酸鐘緩沖液(pH 7.5)配置，含有1.0mmol/L焦憐酸氯化硫胺素，0.1mmol/LFAD，3.0mmol/LMgCl2。
[0040] 本發(fā)明還提供一種所述方法在鑒定或篩選乙酷乳酸合成酶抑制劑中的應用。
[0041] 所述應用包括如下步驟:在測定方法步驟（1)的反應體系中加入不同濃度的篩選 物或鑒定物，空白對照液中加入篩選物或鑒定物相同體積的蒸饋水，其他步驟同測定方法， 通過測定乙酷乳酸合成酶活性鑒定或篩選乙酷乳酸合成酶抑制劑。
[0042] 本發(fā)明提供的利用酶法催化脫簇來測定乙酷乳酸合成酶活性的新方法，可稱為 "酶催化脫簇測定法"。經(jīng)過廣泛試驗證實，本發(fā)明提供的"酶催化脫簇測定法"可用于準確 測定植物、真菌、細菌乙酷乳酸合成酶的活性。本發(fā)明提供的"酶催化脫簇測定法"比"特征 光譜測定法"更準確，適用的生物材料的范圍要廣得多。
[0043] 相比于"硫酸脫簇測定法"，"酶催化脫簇測定法"也具有如下優(yōu)勢：
[0044] ①效率更高："硫酸脫簇測定法"中乙酷乳酸合成反應和脫簇反應分開進行，需要 ?？诎才琶摯夭襟E，而"酶催化脫簇測定法"中乙酷乳酸合成及脫簇反應同步進行，省去了 ?？诿摯夭襟E，因此效率更高；
[0045] ②穩(wěn)定性更高："硫酸脫簇測定法"中需要加入硫酸終止酶促反應和脫簇，結(jié)果使 反應液成強酸性，而后續(xù)的顯色反應需要加入的1-糞酪只溶于堿性溶液，不溶于酸性溶液， 因此在應用過程中發(fā)現(xiàn)若操作不小屯、容易發(fā)生1-糞酪析出產(chǎn)生不溶物的現(xiàn)象，導致測定失 敗，而"酶催化脫簇測定法"無此隱患，因此"酶催化脫簇測定法"比"硫酸脫簇測定法"穩(wěn)定 性更高；
[0046] ③安全性更高："硫酸脫簇測定法"中脫簇反應需要加入硫酸至3mol/L，所加入硫 酸來自濃硫酸，對操作有安全要求，而"酶催化脫簇測定法"無此步驟，因此安全性更高；
[0047] ④專一性更高:硫酸脫簇是一種籠統(tǒng)的脫簇反應，而脫簇酶催化高度專一的脫簇 反應，因此對于粗酶液的測定，"酶催化脫簇測定法"比"硫酸脫簇測定法"的專一性更高，結(jié) 果應該更準確；
[004引⑤更經(jīng)濟："酶催化脫簇測定法"中只需要加入微量的乙酷乳酸脫簇酶，所需費用 與"硫酸脫簇測定法"中加入的硫酸費用相當，但"酶催化脫簇測定法"省去了 "硫酸脫簇測 定法"中需要在6(TC水浴中進行的硫酸脫簇步驟，從能源消耗的角度講，"酶催化脫簇測定 法"比"硫酸脫簇測定法"要更經(jīng)濟。
【附圖說明】
[0049] 圖1是實施例1-例5中測定各生物材料的乙酷乳酸合成酶活性的顯色結(jié)果圖。
[0050] 圖2是實施例1-例5中測定各生物材料的乙酷乳酸合成酶活性時顯色反應產(chǎn)物在 400-620nm波長范圍內(nèi)吸光度的掃描結(jié)果(A:油菜葉片;B:水稻葉片;C:水稻根;D:核盤菌； 6:大腸桿菌）。
[0051] 圖3是實施例6中測定苯橫隆對油菜葉片乙酷乳酸合成酶抑制作用的顯色結(jié)果。
[0052] 圖4是實施例6中苯橫隆對油菜葉片乙酷乳酸合成酶活性抑制率的測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0053] 為進一步說明本發(fā)明，下面結(jié)合實施例子進行具體闡述，但運些實施例子僅是范 例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。在不偏離本發(fā)明的范圍下可W對本發(fā)明技術(shù) 方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但運些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0054] 各實施例子中所用試劑和材料除核盤菌是由發(fā)明人自己分離獲得外，其余均從市 場購買得到。
[0055] 各種試劑的配置：
[0056] ①乙酷乳酸合成酶提取緩沖液下簡稱酶提取緩沖液）：用O.lmol/L憐酸鐘緩沖 液(pH7.5)配置，含有1.0mmol/L焦憐酸氯化硫胺素，0.1mmol/LFAD，3.0mmol/LMgCl2;
[0057] ②反應緩沖液：用50mmol/L憐酸鐘緩沖液(pH 7.0)配置，含有200mmol/L丙酬酸 鋼，0.5mmol/L焦憐酸氯化硫胺素，0.03mmol/L FAD，2.0mmol/L MgCl2;
[0化引③乙酷乳酸脫簇酶:膽備液的酶活力大于2000U/mL(lU/mL指在30°C，pH 6.0條件 下，ImL酶液每分鐘可催化乙酷乳酸脫簇生成?μL?ο? 3-徑基下酬），實驗前用蒸饋水將其稀 釋100倍。
[0059] ④0.5% (W/V)肌酸:用蒸饋水配制；
[0060] ⑤9%(w/v)l-糞酪溶液：用4mol/L NaOH配制；
[0061 ]⑥30 %硫酸:用蒸饋水稀釋濃硫酸配制。
[0062] 酶活測定方法:設置乙酷乳酸合成及脫簇同步反應體系，進行酶促反應：
[0063] ①乙酷乳酸合成及脫簇反應管：向試管中加入1ml粗酶液，1化1稀釋100倍的乙酷 乳酸脫簇酶，1ml反應緩沖液，加入50μ1蒸饋水，充分混勻后于37°C水浴條件下反應化。
[0064] ②調(diào)零用的對照管：向試管中加入50μ1 30%硫酸，加入1ml粗酶液，充分混勻，加 入10μ1稀釋100倍的乙酷乳酸脫簇酶，充分混勻，加入1ml反應緩沖液，再次充分混勻后于37 °C水浴條件下反應化。
[0065] (4)顯色反應：向反應結(jié)束后的各試管中加入0.5% (W/V)肌酸、9% (W/VH-糞酪溶 液各50化1，60°C水