浴加熱15min，室溫下放置15min，取反應(yīng)液于5000巧m離屯、5min，取上清 液，W調(diào)零用的對照管中溶液調(diào)零，用分光光度計(jì)分別測定各反應(yīng)管中反應(yīng)液在530nm波長 處的吸光度As30。
[0066] (5)反應(yīng)液中所含的粗酶液蛋白量的測定：用經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定 粗酶液的蛋白含量，用牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算各管反應(yīng)液中所加入粗酶液 的蛋白量。
[0067] (6)根據(jù)測得的反應(yīng)液的A530及蛋白量，依據(jù)W下公式計(jì)算樣品乙酷乳酸合成酶活 性：
[006引乙酷乳酸合成酶活性=ΔΑ日30/([Pr] . t)
[0069]式中ΔΑ530是W調(diào)零管調(diào)零后測得的As3〇值；[Pr]是反應(yīng)液中所含的粗酶液蛋白量 (Wmg為單位）；t是酶促反應(yīng)時間（Wh為單位）。所得乙酷乳酸合成酶活性的單位為Δ A530 · mg Pr-i · h-1。
[0070] 實(shí)施例1
[0071] W油菜葉片作為高等植物雙子葉植物綠色組織類材料的代表。取油菜（品種為浩 油11)的葉片3-5g，加液氮研磨為粉末，按W/V(葉鮮重g:緩沖液體積ml) = l:5比例加入酶提 取緩沖液，充分混勻，冰浴20min后用兩層紗布過濾，將濾液在4°C，12000巧m離屯、20min，得 到的上清液為粗酶液。
[0072] 然后取粗酶液按照上述酶活性測定的步驟測定乙酷乳酸合成酶活性。測定平行3 管，重復(fù)3次，反應(yīng)液顯示紅色，其中1次測定中平行3管的反應(yīng)液的顯色情況見圖1。
[0073] 隨機(jī)取1管反應(yīng)液在400-620nm范圍內(nèi)對吸光度進(jìn)行掃描的結(jié)果顯示反應(yīng)液在 520-530nm處有特定的吸收峰（圖2)。運(yùn)些顏色變化與吸收峰特征與Singh等人(Analytical Biochemi S try, 1988,171:173-179)用"硫酸脫簇測定法"得到的結(jié)果完全一致。
[0074] 對所測數(shù)據(jù)按照公式乙酷乳酸合成酶活性=AA53〇/([Pr] · t)計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析后得到油菜葉片中的乙酷乳酸合成酶活性平均為0.35(ΔA53o·mgPr-l·l·Γl)(表l)。同 時用文獻(xiàn)報道的"硫酸脫簇測定法"對所得粗酶液進(jìn)行測定，得到的酶活性結(jié)果平均為0.32 (ΑΑ530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。用本發(fā)明提供的"酶催化脫簇測定法'測定的結(jié)果與用"硫酸 脫簇測定法"測定的結(jié)果之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異(P<〇. 05)。
[00巧]實(shí)施例2
[0076] W水稻葉片作為高等植物單子葉植物綠色組織類材料的代表。取水稻（品種為 TN1)的葉片6-lOg，加液氮研磨為粉末，按W/V(葉鮮重g:緩沖液體積ml) = 1:5比例加入酶提 取緩沖液，充分混勻，冰浴20min后用兩層紗布過濾，將濾液在4°C，12000巧m離屯、20min，得 到的上清液為粗酶液。
[0077] 然后取粗酶液按照上述酶活性測定的步驟測定乙酷乳酸合成酶活性。測定實(shí)驗(yàn)重 復(fù)3次。測定平行3管，重復(fù)3次，可W見到反應(yīng)液顯示紅色，其中1次測定中平行3管的反應(yīng)液 的顯色情況見圖1。隨機(jī)取1管反應(yīng)液在400-620nm范圍內(nèi)對吸光度進(jìn)行掃描的結(jié)果顯示反 應(yīng)液在520-530nm處有特定的吸收峰（圖2)。運(yùn)些特征與實(shí)施例1中對油菜葉片測定的現(xiàn)象 類似。
[007引對所測數(shù)據(jù)按照公式乙酷乳酸合成酶活性=AA530/([Pr] · t)計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析后得到水稻葉片的乙酷乳酸合成酶活性平均為0.25( Δ A530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。同時 用文獻(xiàn)報道的"硫酸脫簇測定欺'對所得粗酶液進(jìn)行測定，得到的酶活性結(jié)果平均為0.29 (ΑΑ530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。用本發(fā)明提供的"酶催化脫簇測定法'測定的結(jié)果與用"硫酸 脫簇測定法"測定的結(jié)果之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異(P<〇. 05)。
[0079] 實(shí)施例3
[0080] W水稻的根作為高等植物的非綠色組織類材料的代表。取水稻(品種為TN1)的根， 用蒸饋水清洗干凈，吸水紙吸去表面水分后，稱取5-lOg材料，加液氮研磨為粉末，按W/V(根 鮮重g:緩沖液體積ml ) = 1:5比例加入酶提取緩沖液，充分混勻，冰浴20min后用兩層紗布過 濾，將濾液在4°C，12000巧m離屯、20min，得到的上清液為粗酶液。
[0081] 然后取粗酶液按照上述酶活性測定的步驟測定乙酷乳酸合成酶活性。測定實(shí)驗(yàn)重 復(fù)3次，可W見到反應(yīng)液顯示紅色，其中1次測定中平行3管的反應(yīng)液的顯色情況見圖1。隨機(jī) 取1管反應(yīng)液在400-620nm范圍內(nèi)對吸光度進(jìn)行掃描的結(jié)果顯示反應(yīng)液在520-530nm處有特 定的吸收峰（圖2)。運(yùn)些特征與對油菜葉片、水稻葉片測定的現(xiàn)象類似。圖1中水稻根反應(yīng)液 的紅色比油菜葉片、水稻葉片明顯要淺的原因是因?yàn)閺乃靖么置敢旱牡鞍诐舛缺葟?油菜葉片和水稻葉片獲得的要低得多。
[0082] 對所測數(shù)據(jù)按照公式乙酷乳酸合成酶活性=AA53〇/([Pr] · t)計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析后得到水稻根中的乙酷乳酸合成酶活性平均為2.14( Δ A530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。同時 用文獻(xiàn)報道的"硫酸脫簇測定法"對所得粗酶液進(jìn)行測定，得到的酶活性結(jié)果平均為1.83 (ΑΑ530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。用本發(fā)明提供的"酶催化脫簇測定法'測定的結(jié)果與用"硫酸 脫簇測定法"測定的結(jié)果之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異(P<〇. 05)。
[0083] 實(shí)施例4
[0084] W核盤菌作為真菌類材料的代表。所用核盤菌菌株由發(fā)明人自己分離獲得。核盤 菌的分離方法為:從田間發(fā)生菌核病的油菜莖桿中取出核盤菌菌核，在超凈工作臺上將菌 核用無菌蒸饋水沖洗3次，置于75%酒精中浸泡30s，用無菌蒸饋水沖洗3次，移入0.1%升隸 中浸泡Imin，用無菌蒸饋水沖洗3次，用無菌吸水紙吸去菌核表面水分，然后將其置于PDA固 體培養(yǎng)基上，于22Γ下暗培養(yǎng)至獲得形態(tài)穩(wěn)定的純化菌株，即為核盤菌菌株。
[0085] 測定核盤菌的乙酷乳酸合成酶活性時，先用PD培養(yǎng)基培養(yǎng)核盤菌6d，菌絲接近長 滿錐形瓶，取培養(yǎng)物用兩層紗布過濾，并通過擠壓進(jìn)一步去除培養(yǎng)基，稱取10-20g菌絲，加 液氮研磨為粉末，按W/V(菌絲鮮重g:緩沖液體積ml ) = 1: 2比例加入酶提取緩沖液，充分混 勻，冰浴20min后用兩層紗布過濾，將濾液在4°C，12000rpm離屯、20min，得到的上清液為粗酶 液。
[0086] 然后取粗酶液按照上述酶活性測定的步驟測定乙酷乳酸合成酶活性。測定實(shí)驗(yàn)重 復(fù)3次，可W見到反應(yīng)液顯示紅色，其中1次測定中平行3管的反應(yīng)液的顯色情況見圖1。隨機(jī) 取1管反應(yīng)液在400-620nm范圍內(nèi)對吸光度進(jìn)行掃描的結(jié)果顯示反應(yīng)液在520-530nm處有特 定的吸收峰(圖2)。運(yùn)些特征與上面實(shí)施例1-例3中對各植物組織測定的現(xiàn)象類似。
[0087] 對所測數(shù)據(jù)按照公式乙酷乳酸合成酶活性=AA53〇/([Pr] · t)計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析后得到核盤菌菌絲中的乙酷乳酸合成酶活性平均為1.60( ΔΑ530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。 同時用文獻(xiàn)報道的"硫酸脫簇測定法"對所得粗酶液進(jìn)行測定，得到的酶活性結(jié)果平均為 1.48( ΔΑ530 · mg Pr^i · h^i)(表1)。用本發(fā)明提供的"酶催化脫簇測定欺'測定的結(jié)果與用 "硫酸脫簇測定法"測定的結(jié)果之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異(P<〇. 05)。
[0088] 實(shí)施例5
[0089] W大腸桿菌作為細(xì)菌類材料的代表。用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌(DH 5α)至液 體渾濁(約12h)，用50ml離屯、管分裝后于4000rpm離屯、20min，取沉淀加入適量蒸饋水重新懸 浮，合并多管懸浮液，再次于相同條件下離屯、，棄上清，取沉淀加蒸饋水再懸浮洗涂一次，移 入已稱重離屯、管，離屯、后棄去上清液，倒扣于吸水紙上，稱重，通過前后重量相減估算大腸 桿菌菌體質(zhì)量。取大腸桿菌菌體沉淀約1. Og，按W/V (菌體鮮重g:緩沖液體積ml) = 1:20比例 加入酶提取緩沖液，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎菌體(300W，2.5s工作時間/5s間隔，40min)。 將破碎的大腸桿菌懸浮液于4°C，12000巧m離屯、20m