0pg/ml〇
[0079] 七、抽取RAW264. 7細胞體的全RNA
[0080] 將RAW264. 7小鼠巨噬細胞株胞加至含10 %胎牛血清的DMEM (Dulbecco' s minimal essential medium)培養(yǎng)基，于37°C和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞長 滿后以5X 105細胞/孔的細胞密度接種至24孔盤培養(yǎng)，隔夜待細胞貼附好后移除培養(yǎng)基。 于各孔中添加不同濃度的化合物1和LPS，處理24小時后，去除上清液。于各孔中加入lml 的Trizol (Invitrogen) /孔，蓋上錫箱直至細胞溶解成液狀，各取lml分裝至eppendorf離 心管中。于各離心管中加入200 μ 1的氯仿，震蕩約15秒，于13, OOOrpm和4°C下離心15 分鐘。收集約500 μ 1的上層液，于其中加入等體積500 μ 1異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次混合，放 置室溫2至3分鐘后將其在于13, OOOrpm和4°C下離心15分鐘。去除上清液，加入lml的 75%酒精（4°C )后保存于_20°C。
[0081] 八、反轉(zhuǎn)錄-PCR
[0082] 使用 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega)來進行。由前述 實驗所抽出的全RNA中取出lyg，并于其中加入ΙμL的01igo(dT)15Primer，再于其中 以DEPS水將總體積補為5 μ 1。于70 °C下反應(yīng)5分鐘后，馬上置入冰中至少5分鐘。再 加入 5Xbuffer 4yl、MgCl2(25mM)1.2yl、dNTP Mix(10mM)lyl、RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5yl、ImProm-II 反轉(zhuǎn)錄酶 ΙμL 與DEPC H20 6·8μ1。經(jīng) 25°C、5分鐘，42°C、 1小時和70°C、15分鐘的反應(yīng)，即得到cDNA產(chǎn)物。同時，以不添加反轉(zhuǎn)錄酶的方式制作一個 陰性對照組，以確認是否有DNA污染。將得到的cDNA產(chǎn)物，再經(jīng)由PCR的反應(yīng)來放大預(yù)測 片段。
[0083] 九、實時定量 PCR(Q-PCR)
[0084] 實驗方法：
[0085] 使用 ABI PRISM 7700Sequence Detection System 來測定 cDNA 產(chǎn)物中 iNOS 和IL-6的表現(xiàn)量與β -肌動蛋白基因（內(nèi)標準品）的量。反應(yīng)總體積是20 μ 1，其包含 2 X IQ2SYBR Green Fast qPCR Master Mix (2Χ) 10 μ 1，10 μ Μ 的 5,與 3,引子各 1 μ 1，cDNA 模板1 μ 1，反應(yīng)條件為95 °C、2分鐘、1循環(huán)，95 °C、5秒鐘與60 °C、30秒鐘、40循環(huán)，PCR 反應(yīng)的引子：有義股 iNOS，5'-GGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT-3'（SEQ ID ΝΟ:1)，反義股 iNOS，5，-TCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC-3,（SEQ ID NO:2);有義股 IL-6,5，-CAG AGT CCT TCAGAGAGATACAG-3'（SEQIDNO:3)，反義股IL-6,5'-GATGAATTGGATGGTCTTGGT CC-3'（SEQ ID N0:4);有義股 β-肌動蛋白基因，5'-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3'（SEQ IDNO:5)，反義股β-肌動蛋白基因，5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'（SEQID NO:6)〇
[0086] 十、結(jié)果
[0087] 根據(jù)圖1的ELISA結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物1可有效地抑制RAW264. 7細胞中NO 的產(chǎn)生，亦無明顯的細胞毒性。且經(jīng)計算，化合物1對于NO的IC5。為11. 8 μ M(IC 5。系指在 度量此種回應(yīng)的一項檢測中，最大響應(yīng)的50%抑制作用所需要的化合物量、濃度或劑量）。 此外，圖2有關(guān)IL-6產(chǎn)量的ELISA結(jié)果顯示，本發(fā)明化合物1亦可有效地抑制RAW264. 7細 胞中IL-6的產(chǎn)生，且無明顯的細胞毒性。經(jīng)計算，化合物1對于于IL-6的IC5。為9. 2 μΜ。 尚且，根據(jù)圖3和圖4所示Q-PCR的定量分析結(jié)果，化合物1于濃度分別為50與100 μ g/ml 時，其對iNOS和IL-6的表現(xiàn)確具有顯著的抑制效果。由以上結(jié)果可知化合物1是經(jīng)由抑 制基因表現(xiàn)進而抑制iNOS和IL-6的產(chǎn)生，故化合物1具有調(diào)節(jié)免疫相關(guān)的作用。
【主權(quán)項】
1. 一種具有式（I)的化合物：或其醫(yī)藥上可接受的鹽或溶劑合物， 其中R為氨或烷基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R為C i-Ce烷基。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其系為8-甲氧基糞基-1，7-二醇。4. 一種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求的化合物或其醫(yī)藥上 可接受的鹽或溶劑合物和醫(yī)藥上可接受的載劑和/或賦形劑。5. -種根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求的化合物或其醫(yī)藥上可接受的鹽或溶劑合 物或根據(jù)權(quán)利要求4的醫(yī)藥組合物的用途，其系用W制備用于治療發(fā)炎性疾病的藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述發(fā)炎性疾病為移植物排斥反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、類風濕性 關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、與骨吸收增加相關(guān)的骨骼疾病、回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、己瑞特氏癥候群 度arrett' S syn化ome)、克羅恩氏癥、哮喘、成人呼吸窘迫癥候群、慢性阻塞性呼吸道疾病、 角膜營養(yǎng)不良、沙眼、盤尾絲蟲病、葡萄膜炎、交感性眼炎、內(nèi)眼炎、齒銀炎和牙周炎、結(jié)核 病、麻風、尿毒性并發(fā)癥、絲球體腎炎和腎炎、硬化性皮炎、牛皮癖、濕疹、神經(jīng)系統(tǒng)的慢性脫 髓銷疾病、多發(fā)性硬化癥、AIDS相關(guān)神經(jīng)退化、阿茲海默氏癥、傳染性腦膜炎、腦脊髓炎、帕 金森氏癥、亨下頓氏舞蹈癥、肌萎縮性側(cè)索硬化、病毒性或自體免疫腦炎、自體免疫疾病、免 疫復(fù)合血管炎、全身性狼瘡和紅斑、屯、肌癥、缺血性屯、臟病、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、 慢性肝衰竭、大腦和脊髓創(chuàng)傷、癌癥、革蘭氏陽性或革蘭氏陰性休克、出血性休克、過敏性休 克或由癌癥化療引起的響應(yīng)前發(fā)炎性細胞因子的休克。7. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求的化合物的方法，其中包含： (a)培養(yǎng)披覆炭團菌（Hypo巧Ion investiens)DSM 29586分離株或為與DSM 29586之 菌株具有實質(zhì)上完全相同特征之突變株，W獲得發(fā)酵產(chǎn)物； 化）W正下醇萃取披覆炭團菌發(fā)酵產(chǎn)物，W獲得可溶于正下醇的部分；和 (C)利用洗提液經(jīng)由硅膠層析管柱洗提所述可溶于乙酸乙醋的部分，W獲得式（I)化 合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述步驟（C)包含將所述可溶于正下醇的部分裝載至 硅膠層析管柱中，且利用CHzClz-MeOH的梯度洗提所述管柱。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述步驟（C)可視情況重復(fù)進行W獲得式（I)化合物。10. -種經(jīng)分罔之披覆炭團困株，該披覆炭團困株為保臧于德國微生物困種保臧中屯、 且寄存編號為DSM 29586的菌株，或為與保藏于德國微生物菌種保藏中屯、且保藏編號為 DSM 29586的菌株具有實質(zhì)上完全相同特征之突變株。
【專利摘要】本發(fā)明系關(guān)于一種具抗發(fā)炎活性的化合物。本發(fā)明亦關(guān)于如本案說明書中所述的式(I)化合物：或其醫(yī)藥上可接受的鹽或溶劑合物、包含所述化合物的組合物和所述化合物的制備方法。本發(fā)明亦提供化合物用于治療與發(fā)炎有關(guān)疾病或癥狀的用途。DSM 2958620141031
【IPC分類】A61P37/08, A61P17/06, A61P25/00, A61P35/00, A61P37/00, C12P7/22, A61P1/02, A61K31/085, A61P13/12, A61P1/00, A61P25/16, A61P27/02, A61P19/02, A61P37/06, A61P19/08, A61P13/02, A61P1/16, C07C43/23, A61P31/06, A61P11/06, A61P21/00, A61P9/10, A61P25/14, A61P31/04, A61P11/00, A61P17/00, A61P29/00, A61K31/09, C12R1/645, A61P25/28
【公開號】CN105693481
【申請?zhí)枴緾N201410709741
【發(fā)明人】鄭銘仁, 吳明德, 袁國芳, 劉大維, 謝松源, 陳慧屏, 詹馥菱
【申請人】財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2014年11月28日