Hsp70l1單克隆抗體4e8及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，是一種抗融合蛋白CEA日76-日閒HSP7化I(CH)的 單克隆抗體4E8,產(chǎn)生該種抗體的雜交瘤細(xì)胞株，W及運(yùn)種抗體的免疫檢測用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱休克蛋白化eat shock protein,HSP)家族按照分子量可W分為四類:Hsp90家 族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子化P家族。HSP在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮分子伴侶作用，在新生膚的 正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)W及對異常構(gòu)象蛋白的降解中發(fā)揮重要作用化Ultz D. 2005.Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response.Annu.Rev.Physiol.67: 225-257.)。此外，HSP蛋白及其相連的蛋白多膚在細(xì)胞處于應(yīng)激的條件時(shí)，會W復(fù)合物的形 式釋放到細(xì)胞外。一些HSP，如GRP96，HSP70，HSP90，在細(xì)胞外具有免疫佐劑效應(yīng)，能夠刺激 機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生針對其結(jié)合的蛋白膚段的特異性免疫應(yīng)答（Baker-LePain J.C.， M.Sarzotti,and C.V.Nicchitta.2004.Glucose-regulated protein 94/glycoprotein 96elicits byst曰nder 曰ctiv曰tion of CD4+T cell Thlcytokine production in vivo.J.Immunol.172:4195-4203.Gong J.,Y. Zhang,J.Durfee,D.Weng,C.Liu,S.Koido, B.Song,V.Apostolopoulos,and S.K.Calderwood.2010.A heat shock protein 70-based vaccine with enhanced immunogenicity for clinical use .J. Immunol.184:488-496. Tanaka T.,K.Okuya,G.Kutomi,A.Takaya,T.Kajiwara,T.Kanaseki,T.Tsukahara, Y.Hirohashi,T.Torigoe,K.Hirata,Y.Okamoto,N. Sato, and Y.Tamura.2015. Heat shock protein 90targets a chaperoned peptide to the static early endosome for efficient cross-presentation by human dendritic cells.Cancer Sci.106:18-24.)。
[0003] 服P70L1是HSP70家族的一員，分子量約55kd。同服P70類似，HSP70L1在細(xì)胞外也具 有免疫佐劑效應(yīng)，尤其是能夠刺激一類抗原提呈細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞(demlritic cell，DC)產(chǎn) 生炎性反應(yīng)W及獲得抗原提呈功能的成熟（Wan T.，X.Zhou, G.Chen, H.An, T.Chen, W.Zhang,S.Liu,Y.Jiang,F.Yang,Y.Wu,and X.Cao.2004.NoveI heat shock protein HspTOLlactivates dendritic cells and acts as a Thlpolarizing adjuvant.Blood. 103:1747-1754.)。本室制備的融合蛋白，癌胚抗原（CEA)的576-669段 (CEA576-669)融合至服P7化1的N端的融合蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對CEA的特異性免疫應(yīng)答 反應(yīng)。因此融合蛋白CH可用于針對CEA陽性的腫瘤治療（Wu Y .，T. Wan，X. Zhou，B. Wang， F.Yang,N.Li,G.Chen,S.Dai,S.Liu,M.Zhang,and X.Cao.2005.HspTO-Iike protein !fusion protein enh曰nces induction of c曰rcinoembryonic 曰ntigen-specific CD8+ CTL response by dendritic cell vaccine.Cancer Res.65:4947-4954.)。
[0004] 我們新發(fā)現(xiàn)，編碼融合蛋白（CH)的融合基因修飾的DC細(xì)胞也具有成熟DC的特征， 可W作為DC疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對CEA的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此也可W作為CEA陽性 腫瘤的治療性疫苗（中國專利申請201010108973.9攜帶融合蛋白基因的重組腺病毒及其制 備方法和應(yīng)用）。令人感興趣的是，CH融合基因修飾的一些腫瘤細(xì)胞，能夠上調(diào)表達(dá)MHC-I分 子，運(yùn)暗示利用攜帶融合基因的表達(dá)載體，如重組腺病毒載體，進(jìn)行基因治療，一方面通過 轉(zhuǎn)染CH基因進(jìn)入體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞，如DC，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對CEA的特異性免疫應(yīng)答;另 一方面，通過轉(zhuǎn)染CH基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可W提升腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC-I分子的水平增加被 CTL識別的可能性，也可W在不表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞中引入CEA分子，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生 MHC-CEA來源表位膚，使其能夠被CEA特異性的CTL識別，從而被殺傷清除，實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫治 療的目的。
[0005] 因此，無論將來使用融合蛋白CH進(jìn)行免疫治療、還是融合基因修飾的免疫細(xì)胞進(jìn) 行細(xì)胞治療、W及攜帶融合基因的重組載體的基因治療、都需要對血清、體液或者細(xì)胞中的 融合蛋白CH進(jìn)行免疫檢測，因此，研制出一種結(jié)合特異性高的抗CH的單克隆抗體具有重要 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠具有高親和力、特異性結(jié)合融合蛋白 CEA576-66訊SP70LUCH)的單克隆抗體，及其在制備用于檢測融合蛋白CH的免疫檢測工具中 的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一方面，提供了一種特異性結(jié)合融合蛋白CH的 單克隆抗體4E8，是由保藏編號為CCTCC NO: C201612的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
[0008] 還提供了一種特異性結(jié)合融合蛋白CH的單克隆抗體3C1，是由保藏編號為CCTCC N0:C201626的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
[0009] 本發(fā)明的第二方面，提供了 2株雜交瘤細(xì)胞株CH-4E8和CH-3C1，保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中屯、（簡稱為CCTCC)，保藏日期為2016年1月28日，保藏編號分別為CCTCC NO: C201612和CCTCC N0:C201626。
[0010] 本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：
[0011] 單抗的篩選與制備:采用融合蛋白CH(SEQ ID N0:1)免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟 細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得能 分泌抗CH特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，30株。其中2株巧一為4E8克隆株）的上清靈敏度達(dá)到 0.1 ng/孔(Ing/ml)，其余28株的上清靈敏度達(dá)到Ing/孔(lOng/ml)(結(jié)果見表1)。
[0012] 雜交瘤細(xì)胞分泌上清識別CH來源不同抗原特異性的鑒定:將上述雜交瘤細(xì)胞株的 上清，分別與CEA日76-6閒蛋白和HSP70L1蛋白作為抗原進(jìn)行ELISA檢測，其中有6株上清不識 另Ij，其余24株識別CEA日76-669蛋白。因此，初步判斷有6株單抗識別的位點(diǎn)位于CH蛋白的 HSP70L1段，24株單抗的識別位點(diǎn)位于CEA日76-6閒段(結(jié)果見表2)。
[0013]本發(fā)明的第S方面，提供上述單克隆抗體4E8在制備檢測細(xì)胞內(nèi)融合蛋白CH表達(dá) 的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 所述的試劑或試劑盒是Western Blot、免疫組化或化ISA檢測試劑或試劑盒。所述 的試劑或試劑盒是用于檢測融合蛋白CH融合基因修飾的免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或者其他哺乳 動物細(xì)胞中融合蛋白CH表達(dá)的試劑或試劑盒。
[0015] 本發(fā)明提供了利用單克隆抗體4E8在制備用于檢測細(xì)胞內(nèi)CH蛋白的免疫檢測工具 中的應(yīng)用。具體地，所述免疫檢測工具為4E8單克隆抗體，或者巧光素 W及其他偶聯(lián)物偶聯(lián) 的4E8單克隆抗體。使用本發(fā)明單克隆抗體可W檢測CH融合基因修飾的細(xì)胞中，CH蛋白的表 達(dá)、亞細(xì)胞定位等，可用于進(jìn)一步研究CH在細(xì)胞內(nèi)的功能(結(jié)果見圖2、3)。
[0016] 優(yōu)選的，在上述應(yīng)用中所述的單克隆抗體4E8與單克隆抗體3C1合用。
[0017] 本發(fā)明提供了利用兩株單抗制備的化ISA試劑盒，用該試劑盒可W特異性的檢測 至IjCH，而與HSP7化1和CEA日76-6閒無交叉反應(yīng)，因此可用于將來血清、體液W及細(xì)胞中CH含量 的檢測。方法如下:在識別CH蛋白的雜交瘤中，選擇識別不同抗原表位的單克隆株上清，即 分別選擇識別CEA日76-6閒的上清和可能識別HSP7化1段的上清，進(jìn)行配對。ELISA結(jié)果顯示，特 異性結(jié)合CEA576-6閒蛋白克隆號為4E8的雜交瘤分泌的上清，與特異性結(jié)合HSP7化1蛋白的克 隆號為3C1的雜交瘤上清，檢測CH的靈敏度和特異性最好。分別制備運(yùn)兩株雜交瘤小鼠腹 水，通過親和層析柱分別純化單抗4E8和3C1。將4E8作為捕獲抗體包被于酶標(biāo)板，3C2作為檢 測抗體。通過驗(yàn)證，該對單抗制備成的化ISA試劑盒，特異性、靈敏度W及線性度都適合于將 來的檢測目的(結(jié)果見圖1)。
[0018] 本發(fā)明的第四方面，提供上述單克隆抗體4E8在制備用于檢測CEA陽性腫瘤的 ELISA試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的第五方面，提供上述單克隆抗體3C1在制備檢測細(xì)胞內(nèi)融合蛋白CH表達(dá) 的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的第六方面，還提供了單克隆抗體3C1在制備檢測細(xì)胞內(nèi)天然表達(dá)HSP7化1 的試劑或試劑盒中的應(yīng)用?？捎糜赪B檢測目的，與市售兔源多抗的效果一致。鑒于市售抗 HSP70L1的檢測抗體多為兔源多抗，3C1單抗無疑具有更好的特異性(結(jié)果見圖4)。
[0021] 本發(fā)明的第屯方面，提供了上述雜交瘤細(xì)胞株CH-4E8或CH-3C1在制備檢測細(xì)胞內(nèi) 融合蛋白CH表達(dá)的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。所述的試劑或試劑盒是Western Blot、免疫組 化或ELISA檢測試劑或試劑盒。所述的試劑或試劑盒是用于檢測融合蛋白CH融合基因修飾 的免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或者其他哺乳動物細(xì)胞中融合蛋白CH表達(dá)的試劑或試劑盒。
[0022] 本發(fā)明的第八方面，提供了上述雜交瘤細(xì)胞株CH-4E8在制備用于檢測CEA陽性腫 瘤的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的第九方面，提供一種用于檢測細(xì)胞內(nèi)融合蛋白CH表達(dá)的試劑或試劑盒， 所述的試劑或試劑盒中包括單克隆抗體4E8。
[0024] 優(yōu)選的，所述的試劑或試劑盒中還包括用于Western Blot、免疫組化或化ISA檢測 的其他通用試劑。
[0025] 優(yōu)選的，所述的試劑或試劑盒中還包括單克隆抗體3C1。
[0026] 所述的單克隆抗體4E8也可W組合其他抗HSP7化1抗體用于檢測融合蛋白CH。
[0027] 所述的單克隆抗體4E8還可W組合其他抗體用于檢測融合了 CEA576-668的相應(yīng)融合 蛋白。
[002引本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0029]本發(fā)明所述針對CH蛋白的特異性單抗4E8和3C1，識別融合蛋白CH中的不同表位， 分別位于CH中CEA段和服P7化1段，并且具有高親和力和特異性，奠定了基于CH的免疫治療、 細(xì)胞治療和基因治療中用于CH檢測的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。此外，還建立了基于單抗4E8的免疫巧光技 術(shù)，可用于基于CH基因修飾哺乳動物細(xì)胞的鑒定和功能研究。此外，4E8是明確識別 CEA576-669段，在目前市售的CEA鼠源單抗中，免疫原多CEA全長蛋白或者籠統(tǒng)的標(biāo)明為內(nèi)部 片段，并沒有確定位于本發(fā)明所述的CEA日76-6閒段，因此4E8為CEA陽性腫瘤的診斷添加了一 個(gè)新的檢測工具。
[0030]本發(fā)明所述單克隆抗體可與CH蛋白特異性結(jié)合，而與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白無交叉反 應(yīng)，具有CH蛋白免疫檢測的特異性和可靠性。
[0031 ]生物材料樣品的保藏信