物的多膚。
[0043] 為了解決該任務(wù)，本發(fā)明的特征在于，所述分離的多核巧酸具有編碼多膚的核巧 酸序列，其中所述多膚具有水解玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬衍生物的特性； 并且所述核巧酸序列編碼至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之一的多膚;和/或所述核巧酸序列 與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核巧酸序列具有序列同一性程度，其中所選擇的核巧 酸序列為至少40%;和/或所述核巧酸序列在中等嚴(yán)緊條件下與至少一種選自SEQ ID No. 16-31的核巧酸序列雜交，和/或與具有至少200個(gè)核巧酸，特別是至少100個(gè)核巧酸的其 部分序列雜交，和/或與上述核巧酸序列或其部分序列的互補(bǔ)鏈雜交。
[0044] 待表達(dá)的核巧酸序列，特別是其=聯(lián)體(密碼子），通常隨著宿主細(xì)胞而變化，從而 密碼子偏倚性隨著宿主細(xì)胞而優(yōu)化。運(yùn)導(dǎo)致，具有遠(yuǎn)低于80%，還有低于70%或低于60%的 序列同一性程度的多核巧酸也可W編碼同一種多膚。用于確定序列同一性程度的序列比較 還必須在序列區(qū)段內(nèi)進(jìn)行，其中區(qū)段是指參考序列的連續(xù)序列。對于核巧酸序列，序列區(qū)段 的長度通常為15至600。
[0045] 借助于現(xiàn)有的分離的核巧酸序列或序列區(qū)段，可成功產(chǎn)生具有通常至少15、30或 40個(gè)核巧酸的長度的核酸探針。借助于此類探針(其通常另外還例如用化、 32P、35S、生物素或 抗生物素蛋白進(jìn)行標(biāo)記)可W通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法來鑒定編碼具有降解ZEN和/或ZEN衍生物 的作用的多膚的核巧酸序列。作為用于鑒定此類序列的起始材料，可W考慮例如單個(gè)微生 物的DNA、RNA或cDNA，基因組DNA文庫，或者cDNA文庫。
[0046] 對于具有至少100個(gè)核巧酸的長度的核巧酸序列或核巧酸探針，中等嚴(yán)緊條件被 定義為在42°C下在包含0.3 %十二烷基硫酸鋼（SDS)、20化g/ml經(jīng)剪切和變性的娃精DNA和 35%甲酯胺的配備有5X化Cl的Na-邸TA緩沖液（SS陽，0.9MNaCl，60mM化H2P04,6mM抓TA) 中的預(yù)雜交和雜交，隨后為標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡條件，其中最后將載體材料用2X的氯化鋼-巧樣酸鹽緩沖液(SSC，300mM化Cl和30mM巧樣酸S鋼，0.2%505)在55°(：下洗涂15分鐘，進(jìn) 行立次。
[0047] 對于具有15個(gè)核巧酸至100個(gè)核巧酸的長度的核巧酸序列或核巧酸探針，中等嚴(yán) 緊條件被定義為在由0.9M 化CK0.09M IYis-HCl pH = 7.6、6mM 抓TA、0.5%NP-40、1X Denhar化溶液、ImM焦憐酸鋼、ImM憐酸二氨鋼、0.1 mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA組成的緩沖液 中的預(yù)雜交和雜交，其中在比計(jì)算出的解鏈溫度(Tm)低5°C至10°C的溫度下進(jìn)行預(yù)雜交和 雜交，其中Tm通過按照Bolton和Mc(^i;rthy(1962,Proceedings of the 化tional Academy of Sciences USA,48:1390)進(jìn)行的計(jì)算來確定。隨后，該試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡條件下 繼續(xù)進(jìn)行（J . Sambrook ,E.F.Fritsch 和 T. Maniati S ,1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor,化W化rk)。最后，將載體材料用包含 0.1 % SDS的6 X SCC緩沖液洗涂15分鐘，進(jìn)行一次;和在各自處于比計(jì)算出的Tm低5 °C至1 (TC 的溫度下用6 X SSC緩沖液洗涂15分鐘，進(jìn)行兩次。
[0048] 此外，本發(fā)明還旨在，提供添加劑W供使用，用所述添加劑可成功實(shí)現(xiàn)在確定的或 復(fù)雜的基質(zhì)中，例如在飼料或食品中，快速且可靠地W水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN 衍生物。
[0049] 為了解決該任務(wù)，提供了 W水解方式裂解玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉 締酬衍生物的添加劑W供使用，其中所述添加劑包含至少一種具有選自SEQ ID No.1-15的 氨基酸序列或其功能性變體的多膚，其中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之 間的序列同一性為至少40% ;并且任選地包含助劑。
[(K)加]用運(yùn)樣的添加劑，可成功實(shí)現(xiàn)ZEN和/或至少一種ZEN衍生物向經(jīng)水解的ZEN和/或 經(jīng)水解的ZEN衍生物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。例如對于在工業(yè)過程中ZEN和/或ZEN衍生物的立體選 擇性水解，也可W考慮該添加劑。
[0051] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步改造方案中，如此地產(chǎn)生所述添加劑，即所述助劑 選自至少一種惰性載體，W及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質(zhì)和/或酶和/或其 他用于使真菌毒素解毒的組分。通過使用運(yùn)樣的添加劑，可W例如在飼料或食品中確保，所 任選地包含的ZEN和/或ZEN衍生物的量安全可靠地被水解特別是解毒至如此程度，從而對 于攝取運(yùn)些飼料或食品的受試者的機(jī)體沒有有害效應(yīng)。
[0052] 在運(yùn)種情況下，根據(jù)本發(fā)明的多膚也可W存在于酶制劑中，所述酶制劑除了包含 至少一種根據(jù)本發(fā)明的多膚外，還包含至少一種酶，所述酶例如參與蛋白質(zhì)的降解，例如蛋 白酶，或者所述酶參與淀粉或纖維或脂肪或糖原的代謝，例如淀粉酶、纖維素酶或葡聚糖 酶，W及例如水解酶、脂解酶、甘露糖巧酶、氧化酶、氧化還原酶、植酸酶、木聚糖酶和/或其 組合。
[0053] 本發(fā)明的其他使用范圍為酶制劑，其除了包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的多膚外，還 包含至少一種用于使真菌毒素解毒的組分，例如真菌毒素降解酶，例如黃曲霉毒素氧化酶、 麥角胺水解酶、麥角胺酷胺酶、玉米赤霉締酬醋酶、玉米赤霉締酬內(nèi)醋酶、髓曲毒素酷胺酶、 串珠鑲抱菌素簇酸醋酶、串珠鑲抱菌素氨基轉(zhuǎn)移酶、氨基多元醇氨基氧化酶、脫氧瓜萎鑲菌 醇環(huán)氧化物水解酶;和/或至少一種降解真菌毒素的微生物，例如枯草芽抱桿菌;和/或至少 一種結(jié)合真菌毒素的組分，例如微生物細(xì)胞壁或無機(jī)材料例如膨潤±。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的進(jìn)一步改造方案，在所述添加劑中，所述多膚W最 高10，OOOU/g，優(yōu)選地最高1，OOOU/g，更優(yōu)選地最高lOOU/g，和最優(yōu)選地最高lOU/g的濃度包 含在其中，由此可成功實(shí)現(xiàn)將ZEN和/或ZEN衍生物快速地，和特別地在其由消耗了被污染的 飼料或食品的受試者(特別是哺乳動(dòng)物）的身體吸收之前，已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒或低毒的代謝 物，特別是監(jiān)E財(cái)陽監(jiān)EN。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，所述多膚W經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的形式存在，其 中對于所述包囊或包衣過程，可W考慮標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在WO 92/12645中所描述的那些。通 過所述包囊或包衣過程，可成功實(shí)現(xiàn)將所述多膚運(yùn)輸至其使用位點(diǎn)，而沒有改變，特別是沒 有降解或損害，從而在保護(hù)殼溶解(例如在動(dòng)物的消化道中）之后，所述多膚才開始起作用， 由此在酸性的、富含蛋白酶的和缺氧的介質(zhì)中也可W達(dá)到ZEN和/或ZEN衍生物的更加有針 對性的、快速的和完全的降解。此外，通過所述包囊或包衣過程，還可成功提高在所述添加 劑中所述多膚的溫度穩(wěn)定性。
[0056] 此外，本發(fā)明還旨在，所述添加劑用于W水解方式裂解在飼料(其特別地用于豬、 家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖）中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬 衍生物的用途。通過根據(jù)本發(fā)明來使用所述添加劑，可成功實(shí)現(xiàn)將在食物或飼料中或者在 干酒糟中所包含的ZEN和/或ZEN衍生物水解或解毒，其中在大約lU/g被污染的飼料或食物 的多膚濃度的情況下已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了運(yùn)樣的解毒。
[0057] 此外，本發(fā)明還旨在，提供運(yùn)樣的方法W供使用，用所述方法使得ZEN和/或至少一 種ZEN衍生物的快速且可靠的水解式裂解成為可能。
[0058] 為了解決該任務(wù)，如此地來施行所述方法，從而玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米 赤霉締酬衍生物被具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的多膚水解，其 中在所述功能性變體與至少一個(gè)所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，如此地來施行所述方法，從而其中在相應(yīng)于 本發(fā)明的添加劑中使用所述多膚。
[0060] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步發(fā)展方案，如此地來施行所述方法，從而其中將所述多膚 或添加劑與被玉米赤霉締酬和/或被至少一種玉米赤霉締酬衍生物污染的飼料或食物相滲 混，使所述被污染的飼料或食物與濕氣相接觸，并且所述多膚或添加劑水解在所述被污染 的飼料或食物中所包含的玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬衍生物。在濕潤的飼 料或食物例如麥芽漿或糊漿的情況下，玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬衍生物 的水解在經(jīng)口攝取之前在該濕潤的飼料或食物中發(fā)生。通過該方法可W確保，最大程度地 消除玉米赤霉締酬和玉米赤霉締酬衍生物對于人和動(dòng)物的有害效應(yīng)。在此，濕氣是指水或 含水液體的存在，其中例如唾液或其他在消化道中存在的液體也屬于該范疇。消化道被定 義為口腔、咽（咽喉）、食管和胃腸道或者其等價(jià)物，其中在動(dòng)物中可W存在不同的名稱或者 個(gè)別成分可W不存在于動(dòng)物的消化道中。
[0061 ]本發(fā)明的方法還可W如此地來施行，從而將所述飼料或食物在經(jīng)口攝取之前進(jìn)行 粒化。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步改造方案，如此地來施行所述方法，從而至少70%，優(yōu)選 地至少80 %，特別優(yōu)選地至少90%的所述玉米赤霉締酬和/或至少一種玉米赤霉締酬衍生 物被水解。由此可W預(yù)防在動(dòng)物或人中的亞急性和/或亞慢性的毒性效應(yīng)，例如致崎形的、 致癌的、動(dòng)情的和免疫抑制的效應(yīng)。
[0063] 下面將依據(jù)實(shí)施例W及附圖更詳細(xì)地闡明本發(fā)明。其中：
[0064] 圖1顯示了通過具有SEQ ID No.1的多膚來進(jìn)行的ZEN的隨時(shí)間的降解W及代謝物 監(jiān)EN和D監(jiān)EN的增加，其中在圖IA中，所述多膚未加標(biāo)簽，在圖IB中，所述多膚具有C-末端6 XHis標(biāo)簽，和在圖IC中，所述多膚具有N-末端6 XHis標(biāo)簽。
[00化]圖2顯示了具有沈Q ID No. 1的多膚的米-曼(Michaelis-Menten)動(dòng)力學(xué)。
[0066] 圖3顯示了通過經(jīng)純化的具有SEQ ID No.l(圖3A)、沈Q ID No.2(圖3B)、SEQ ID 齡.5(圖3〇、沈910齡.6(圖30)、56910齡.7(圖36)、沈910齡.9(圖3尸）、沈910齡.11 (圖3G)、SEQ ID No.12(圖3H)和SEQ ID No.15(圖31)的多膚來進(jìn)行的ZEN的隨時(shí)間的降解 W及代謝物監(jiān)EN和畑ZEN的增加，其中所有序列均具有C-末端6 X Hi S標(biāo)簽。
[0067] 實(shí)施例1:編碼能夠W水解方式裂解ZEN和/或至少一種ZEN衍生物的多膚的多核巧 酸的修飾、克隆和表達(dá)
[0068] 按照說明書，使用"Quick-change Site-directed Mutagenesis Kits" (Stratagene)，借助于PCR，通過核巧酸序列的突變來進(jìn)行氨基酸置換、插入或缺失。備選 地，為此還購進(jìn)了完整的核巧酸序列(GeneArt)。借助于PCR誘變而產(chǎn)生的或從GeneArt購進(jìn) 的核巧酸序列在氨基酸水平上可選地另外還包含C-末端或N-末端6X化S標(biāo)簽，并且借助于 標(biāo)準(zhǔn)方法將其整合到用于在大腸桿菌化.CO 1 i)或己斯德畢赤酵母(P. pastoriS)中進(jìn)行表 達(dá)的表達(dá)載體之中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或己斯德畢赤酵母中，W及在大腸桿菌或己斯德畢赤 酵母中進(jìn)行表達(dá)（J.M. Cregg ,PicMa Protocols，第二版，ISBN-IO :1588294293、2007; J. Sambrook等人，2012,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第4片反，Cold Spring 化rbor)，其中也可W為該任務(wù)考慮任何其他合適的宿主細(xì)胞。
[0069] 名稱"表達(dá)載體"設(shè)及能夠在體內(nèi)或在體外表達(dá)基因的DNA構(gòu)建體。特別地，該名稱 涵蓋運(yùn)樣的DNA構(gòu)建體，其適合于將編碼所述多膚的核巧酸序列轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，W便在 那里整合到基因組中或者游離地存在于染色體外空間中，并且在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼所述多膚 的核巧酸序列和任選地從細(xì)胞中提取出所述多膚。
[0070] 名稱"宿主細(xì)胞"設(shè)及所有運(yùn)樣的細(xì)胞，其要么包含待表達(dá)的核巧酸序列，要么包 含表達(dá)載體，并且能夠制備根據(jù)本發(fā)明的多膚。特別地，該名稱涵蓋原核細(xì)胞和/或真核細(xì) 胞，優(yōu)選地己斯德畢赤酵母，大腸桿菌，枯草芽抱桿菌，鏈霉菌屬(Streptomyces),漢遜酵母 屬（Hansenula)，木霉屬（Trichoderma)，乳桿菌屬（Lactobacillus)，曲霉屬 (Aspergillus),植物細(xì)胞，和/或芽抱桿菌屬(Bacillus)、木霉屬或曲霉屬的抱子。
[0071] 為了測定多膚的催化特性，在大腸桿菌的情況下考慮可溶的細(xì)胞裂解物，或者在 己斯德畢赤酵母的情況下考慮培養(yǎng)物上清液。為了測