驗中，W與對于測定最佳抑所 使用的濃度相同的各自多膚的濃度，在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的處于各自最佳抑下 的IOOmM化is-HCl緩沖液中，在批料中使用運些經(jīng)預(yù)溫育的樣品。在O小時、0.5小時、I小 時、2小時和3小時的溫育時間后進(jìn)行取樣。隨后，將多膚在99°C下加熱失活10分鐘，并且將 樣品膽存于-2(TC。在解凍后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，并且如在實施例帥所描述的那樣 借助于HPLC-DAD來進(jìn)行分析。將抑穩(wěn)定性定義為在抑5.0下多膚的殘余活性百分比，相對 于在各自最佳抑下的活性而言。對于抑5.0的抑穩(wěn)定性顯示在表11中。
[0143] 表11:在抑5.0下多膚的抑穩(wěn)定性。
[0144]
[0145] 實施例12: ZEN降解試驗
[0146] 示例性地對于具有沈Q ID No. 1、2、5、6、7、9、11、12和15的多膚，進(jìn)行ZEN至監(jiān)EN和 畑ZEN的降解。所述降解批料在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的Teorell Stenhagen緩沖液 (pH 7.5)中實施制備。在30°C下溫育所述降解批料。在0小時、0.5小時、1小時、2小時和3小 時的溫育時間后進(jìn)行取樣。隨后，將多膚在99°C下加熱失活10分鐘，并且將樣品膽存于-20 °C。在解凍后，將樣品轉(zhuǎn)移到HPLC小瓶中，并且如在實施例8中所描述的那樣借助于HPLC-DAD來進(jìn)行分析。如此地來選擇多膚濃度，從而在大約3小時后達(dá)到完全的降解。降解動力學(xué) 描繪在圖3中，其中y軸顯示了 W微摩爾/升(皿01 /1)表示的ZEN、監(jiān)EN和DHZEN的濃度，和X軸 顯示了 W小時化)表示的溫育時間。
[0147] 郵M表示微體積摩爾濃度，并且相應(yīng)于單位WIio VI。
【主權(quán)項】
1. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其特征 在于，所述多肽是具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶，其中 在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一個保守氨基酸序列區(qū)段或 其功能性變體，其中所述氨基酸序列區(qū)段的功能性變體具有至少70%，優(yōu)選地至少84%，更優(yōu) 選地至少92%，和最優(yōu)選地至少98%的序列同一性，并且所述至少一個保守氨基酸序列區(qū)段 選自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+145、+ 150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257至+261、+ 263 至+270、+272 至+279、+297 至+301、+303至+313、+24至328、+1至+328。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其特征在于，所述功能性變體具有選自下列的氨基酸修 飾:各自一個或多個氨基酸的置換、缺失和插入。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有至少0.01U/mg，優(yōu)選地 至少0.1U/mg，特別地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，優(yōu)選地最高3.5μΜ，特別 地最高〇. 5μΜ的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的Km值，和/或具有至少0. Οδ?Γ1，優(yōu)選地至少 〇. 6JT1，特別地至少δ?Γ1的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的1^*值，和/或具有至少0. ΟΟΟΟΙμ Μ?，優(yōu)選地至少Ο.ΟΟΟΙμΜ?，特別地至少Ο.ΟΟΙμΜ^?Γ1的以水解方式裂解玉米赤霉 稀酮的Vmax值。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 2、5、6、 7、9、11和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序 列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH穩(wěn)定性為至少15%，優(yōu)選地 50%，和特別優(yōu)選地至少90%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No.l、2、5、 6、7、9、11、15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所述氨基酸 序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30°C和75°C之間，優(yōu)選地38°C和55°C之 間，特別優(yōu)選地38°C和52°C之間的溫度范圍內(nèi)具有最高的酶促活性。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含選自SEQ ID No. 1、5、6、 9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性變體，其中所述功能性變體與至少一個所述氨基酸 序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是溫度穩(wěn)定的，直至90°C，優(yōu)選地75°C，和特 別優(yōu)選地60°C的溫度。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個選自下列的位置 處具有關(guān)于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一個突變:22、23、25、26、27、29、31、32、35、 37、42、43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、 141、146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、 197、198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、 231、233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、 280、281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、 321、323、325和326。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的多肽，其特征在于，所述多肽具有選自下列的關(guān)于SEQ ID No.l的 氨基酸序列的至少一個突變:D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、R31A、F32Y、 R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、P72E、 V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、A141S、 I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、A172G、 A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、V197R、 E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、L210A、 L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、G229A、 A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、S248N、 S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、E269N、 L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、I286M、 R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、A311P、 A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的多肽，其特征在于，包含至少一個選自SEQ ID No. 32-69 的下列氨基酸基序。11. 根據(jù)權(quán)利要求9的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一個位置處包含至少一個保 守氨基酸置換，并且所述保守氨基酸置換選自：G至A;或A至G、S;或V至1丄^、1\3;或1至￥、 L、M;或L至I、M、V;或 Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或F至Y、W、H;或Y至F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、 E、D;或K至R、E、D;或H至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q ;或E至Q、D、K、R、N;或S至T、A;或T至S、V、A; 或C至S、T、A;或N至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置換。12. 分離的多核苷酸，其具有編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有水解玉米赤霉 烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的特性，其特征在于，所述核苷酸序列編碼至少一 種根據(jù)權(quán)利要求1至11之一的多肽;和/或所述核苷酸序列與至少一種選自SEQ ID No.16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所選擇的核苷酸序列為至少40%;和/或所述核 苷酸序列在中等嚴(yán)緊條件下與至少一種選自SEQ ID No.16-31的核苷酸序列雜交，和/或與 具有至少200個核苷酸，特別是至少100個核苷酸的其部分序列雜交，和/或與上述核苷酸序 列或其部分序列的互補鏈雜交。13. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的添加劑，其特 征在于，所述添加劑包含至少一種具有選自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或其功能性變體 的多肽，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少 40% ;并且任選地包含助劑。14. 根據(jù)權(quán)利要求13的添加劑，其特征在于，包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之一的 多肽。15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14之一的添加劑，其特征在于，所述助劑選自：至少一種惰性載 體，以及任選地，其他成分，例如維生素和/或礦物質(zhì)和/或酶和/或其他用于使真菌毒素解 毒的組分。16. 根據(jù)權(quán)利要求13、14或15之一的添加劑，其特征在于，在所述添加劑中，以最高10， 〇〇〇U/g，優(yōu)選地最高1，000U/g，更優(yōu)選地最高100U/g，和最優(yōu)選地最高10U/g的濃度包含至 少一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之一的多肽。17. 根據(jù)權(quán)利要求13至16之一的添加劑，其特征在于，所述添加劑以經(jīng)包囊或經(jīng)包衣的 形式存在。18. 根據(jù)權(quán)利要求13至17之一的添加劑用于以水解方式裂解在飼料中、在食物中或在 中的玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的用途，所述飼料特別地為用于豬、 家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的飼料。19. 用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方法，其 特征在于，所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生物被具有選自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性變體的多肽水解，其中在所述功能性變體與至少一個所 述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40%。20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于，在根據(jù)權(quán)利要求14至17之一的添加劑中使用 所述多肽。21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于，將所述多肽或添加劑與被玉米赤霉烯酮和/ 或被至少一種玉米赤霉烯酮衍生物污染的飼料或食物相摻混，使所述被污染的飼料或食物 與濕氣相接觸，并且所述多肽或添加劑水解在所述被污染的飼料或食物中所包含的玉米赤 霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物。22. 根據(jù)權(quán)利要求19至21之一的方法，其特征在于，至少70 %，優(yōu)選地至少80 %，特別優(yōu) 選地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一種玉米赤霉稀酮衍生物被水解。
【專利摘要】以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其是具有選自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或其功能性變體的水解酶，其中在所述功能性變體與至少一個所述氨基酸序列之間的序列同一性為至少40％；以及包含所述多肽的添加劑；以及編碼所述多肽的分離的多核苷酸；以及用于用所述多肽來以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一種玉米赤霉烯酮衍生物的方法。
【IPC分類】C12N9/14, C12N15/55, A23K20/189
【公開號】CN105705637
【申請?zhí)枴緾N201480055221
【發(fā)明人】S·弗魯豪夫, M·薩姆海塞爾, M·費菲爾, D·摩爾, G·沙特茲邁爾, E·M·賓德
【申請人】愛爾伯股份公司
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2014年8月27日
【公告號】CA2922178A1, EP3039134A2, EP3039135A2, WO2015027258A2, WO2015027258A3, WO2015027259A2, WO2015027259A3